電気泳動の時のゲル、マーカーetcについて…

質問

アガロースゲル電気泳動において、1%ゲルと2.5%を選択する時の基準は何でしょうか？

またゲルにアプライする時、sampleを何μ、6×loading buffer を何μ～などの組成がどうしたら良いのか分かりません。
先日学校の授業で、『sampleを0.5μ、6×loading bufferを1μ、TAEを4.5μ混ぜてアプライして』と先輩に言われましたが、何でか聞けずで。。。しかもこの前はTAEを混ぜなかったのに…と個人的に思いました。

その時、分子量マーカー100bpと500bpをアプライしたのですが、『100bpマーカーは3μと6μ、500bpは6μアプライして』と言われたのですが、何故100bpを3μと6μで分けてアプライしたのかが分かりませんでした。

どなたかご丁寧に教えていただけないでしょうか。
宜しくお願い致しますm（__）m

回答No.1

geneticist12 · ベストアンサー

アガロース濃度によって、分離に適したDNAサイズの範囲が異なります。
簡単に言うと、目的のDNAサイズが長いほど低濃度に、短いほど高濃度にします。
http://clontech.takara-bio.co.jp/product/catalog/010001006.shtml

ある濃度のゲルの分離範囲に対して短い過ぎるDNAや長すぎるDNAは、サイズの違いによる移動度の違いが出にくくなって、近接するサイズのバンド同士の分離が悪くなったり、バンドがぼやけてしまったりします。

6x loading bufferの6xとは、6倍希釈して終濃度が1xになるようにして使うべし、ということです。
5 uLのサンプル溶液にたいして1 uL加えるとその状態になります。
0.5 uLのサンプルには、0.1 uLでは液量が少なすぎて扱いづらいですから、4.5 uLの1x TAEを加え5 uLにしたところに1 uLの6x loading bufferを加えたわけですね。
このようにサンプル体積が少ないときによくやるのは、あらかじめ適当なバッファーで希釈した1x loading bufferを適当量（アプライに適した量）サンプルに加える方法です。それでは正確に1xにならないじゃないかと思われるかもしれませんが、loading bufferは多くの場合バッファー成分は含まれず、比重を高めるためだけなので厳密に1xでなくてもかまいません。

加えるのは1x TAEではなくても、たとえばTEなどの低塩濃度の中性付近のバッファであれば何でもいいです。ただし、水で希釈するのは、バッファリングが不十分になって移動度が変わってしまうことがあるので避けます。

マーカーの量を変えて複数アプライする理由としては、異なる量のマーカー（既知量）をのせておいて、これとサンプルDNAの染色強度を比較することによってサンプルのDNA量を推定するため、ということがあります。

お礼

全ての疑問に対し、ご丁寧に分かり易く教えて下さり誠にありがとうございます。

これで疑問が解け、明日から理解しながら実験に手をつけれると思います。

本当にありがとうございました。