マウスのGenomic DNAの扱いの際

質問

Tail Lysisする時、Lysis bufferにはProteineseK,Buffer,NP-40,蒸留水が入っているのですが、ProteineseKとNP-40の役割について教えていただきたいです。

Mouse TailをLysis bufferに入れて、６０℃くらいの温度で溶かし、その後９５℃で３０min　ProteineseKを失活させるんですが、これの原理についても教えてください。大体わかっているのですが、詳しく知っておきたくて・・
よろしくお願いします。

回答No.2

miya_0726 · ベストアンサー

前回のを投稿した後に、説明不足なことに気がつきました。
補足させてください。

そもそも細胞は、ゲノムDNAのみならず様々なコンポーネントから構成されていますが、DNAを抽出するに当たって障害となるのは細胞膜とタンパク質です。
細胞膜を破壊するのに使われるのが界面活性剤で、割とよく使われるのがSDSなのですが、質問者様の例ですとNP40がその役割を担っているものと思われます。
細胞膜を破壊できますと、今度は細胞内にあるタンパク質やゲノムDNAが巻きついているヒストンタンパク質などを分解しないと綺麗なゲノムDNAをとることができません。DNAを沈殿する際にこういったタンパク質も沈殿してきてしまうためです。このタンパク質を分解するのがProteinaseKです。この反応の際に、前回書きましたようにNP40も補助的に働いていると考えられます。
NP40で細胞膜を壊し、NP40とProteinaseKでタンパク質を分解しているとお考えください。

お礼

２度目の回答ではっきりと理解できました！基本的な質問で申し訳ありません。
とっても助かりました！ありがとうございました★

回答No.1

miya_0726

ProteinaseKはその名前の通りタンパク質分解酵素で、これは非特異的にタンパク質をオリゴペプチドまたはアミノ酸に加水分解する酵素です。
また、NP40は非イオン型界面活性剤の一種で、タンパク質の立体構造を壊してProteinaseKによる分解を受けやすくさせる働きがあります。ProteinaseK耐性の細胞内タンパク質もたくさんあり、こういったものも積極的に分解するために添加するのです。

ProteinaseK自体もタンパク質ですから、95℃で30min置くことでおそらくProteinaseKの立体構造が崩れるはず。その後は低温に戻しても活性型立体構造には戻れないことを利用した失活方法です。

お礼

回答ありがとうございます。
ではマウスのDNAを抽出するのに、尻尾を蛋白質分解酵素でとかして抽出してるということでよいですか。