FCMのブロッキング抗体、コントロール抗体について

質問

大学院で癌細胞をあつかっている学生です。今は、細胞表面のレセプター解析のためにFCMを使っています。
ブロッキング抗体とバックグラウンドとなるコントロール抗体の選び方がよくわかりません。
マウス由来の抗体でヒト細胞を染めるときは、抗マウスIgGに対するブロッキング抗体と抗マウスIsotypeコントロール抗体が必要なのでしょうか？
それとも、マウス由来のヒトIgGに対するブロッキング抗体と、抗ヒトIsotype抗体（見たことがないけど）が必要なのでしょうか？
指導教官が留学してしまい、わからないことだらけになってしまいました。

回答No.2

alanami

サンプルは培養細胞とのことなので、一度練習でブロッキング無しでやってみてはいかがでしょうか。恐らく細胞表面抗原を染色するのであれば、バックグラウンドは殆ど出ないとおもいます。細胞内を染色するとバックグラウンドが出るのでその時は抗体の免疫動物由来の血清でブロッキングしています。動物施設が近くにあればマウスから採血してくれば良いと思います。文面から１カラー染色のようですので、補正も気にせず行えるので幾つかサンプルを用意してみると良いです。お手持ちのビオチン化抗体のサブクラスがもしIgG1とすると、
（１）何も処理しない細胞
（２）２次抗体（PE-sav）のみ作用させた細胞
（３）ビオチン化IgG1 isotype cont抗体+PE-sav
（４）見たいビオチン化IgG1抗体+PE-sav

ビオチン＋savの系は検出感度が上昇するので、sav-PEの濃度は何点か
取ったほうが良いかもしれません。がんばってください。

お礼

ありがとうございます。
先生のアバイスを参考に実験を続けたいと思います。

回答No.1

alanami

私のマウス、ヒトともに主にリンパ球を染める場合ですが。
マウスの時は2.4G2を用いてFcブロックを行ってから、目的の
抗体を反応させてます。ヒトの時は特別ブロッキング抗体は
使用してないです。
質問中に、isotypeコントロールで抗マウスisotypeとありますが、
抗ヒト、マウスisotyoeコントロール抗体ですね。
また染める抗体がポリクロかモノクロか、更に抗体が標識抗体か、２段階で染めるのかでも条件は変わってきます。

お礼

早速のご回答ありがとうございます。
ブロッキングは必要な場合と、そうでない場合があるのですね。

今回用いるのは、ビオチン化されたマウス由来のモノクローナル抗体です。二次抗体にはPE化されたストレプトアビジンを用います。
細胞はHUVECです。
この場合は、ブロッキングは必要でしょうか？やってみないとわかりませんｄしょうか？