培養細胞の核での免疫染色

質問

はじめまして。いつも参考にさせて頂いてます。

培養細胞での免疫染色で困っているので伺いたいのですが、現在核内の転写因子に対する抗体を用いて、培養細胞で免疫染色を行っています。
しかし、なかなかきれいに染まらず（核のシグナルが弱く、細胞質がぺたーと染まってしまう）困っています。

抗体は、マウスの組織を用いてきちんとワークしている（核がきちんと
染まっている）事を確認し、その細胞で目的の遺伝子が発現している事はリアルタイムRT-PCRで確認しています。

プロトコルとしては、
スライドガラスに細胞を貼付ける→4%PFAで固定(4℃、20分)→0.1% TritonX100で可溶化（4℃、15分）
→3%BSAでブロッキング→１次抗体(4℃、O/N)→２次抗体（RT,1h）→ヘキストで核染色
各ステップ間にPBSで３回Washを行っています。

細胞質が染まる事は２次抗体のバックではない事は確認しました。
何か些細な事でも構いませんので、何か注意点等ありましたら、よろしくお願い致します。

回答No.3

qrl

私も培養細胞の免疫染色はいつも苦労します。他の回答者さんも述べていますが、固定条件ではないでしょうか。
私の経験ではＰＦＡで固定したところ細胞質のみ染まるはずの抗体が核も一様に染まるので、100 % metanol、-20 ℃、20 minに変えただけで上手くいったことがあります。同じ分子で上手く免疫染色をしている論文を見つけてマテリアル＆メソッドをチェックしてみてはいかがでしょうか。

お礼

ご連絡が遅れました。
あいにくこの分子を蛍光で染めている論文がないので、今色々試しているところです。（APなどはありましたが、実験の都合上蛍光で行わなければならず、またサンプル組織も異なるため、同一方法での処理では上手く染められませんでした。）

やはりメタノールで試すのが良い様ですね。以前メタノールで試した時に細胞が縮んでしまったので諦めていましたが、そのときの手技が恐らく良くなかったのでしょう。
改めて試してみたいと思います。
ありがとうございました。

回答No.2

tatoo

＞抗体は、マウスの組織を用いてきちんとワークしている（核がきちんと
染まっている）事を確認し、

組織の切片はどのようにして作製したものだったのでしょうか？
パラホルム固定？
パラフィン？凍結？

組織に切片においての検出方法は何だったのでしょうか？
蛍光？アルカリフォスファターゼ？ホースラディッシュ？

抗体のデータシートはあるでしょうか？
そこにどのような固定法でいけると書いてありませんでしょうか？
IHCはいけるけど、IFはだめとか書いてないでしょうか？

補足

情報が少なくて申し訳ありません。

組織は4%PFAで固定した後、30% スクロースで置換し、凍結切片を作成しました。
検出方法は蛍光で行っています。（その後の実験の都合で、APなどではなく蛍光で行う必要があるため）

抗体のデータシートは以前確認したのですが、固定方法に関する記述はありませんでした。
またIHCに関しては希釈倍率等が書いてあり、IFは書いてなかったのですが、IFがダメ、とも書いてないのでIFでも行えるのかなと考えています。

回答No.1

geneticist12

私なら、まず固定法を変えて試してみるかな。組織切片と細胞のwhole mountだと、条件が異なっていてもおかしくないですから。
例えば、細胞固定や核の固定に適しているといわれる、酢酸エタノール（またはメタノール）（1:3）、Carnoy、Methacarnなど。これらを使う場合は、浸透性を高めるための界面活性剤処理はいらないでしょう。

ひょっとすると、培養細胞で細胞質が染まり、核が染まらないのはそういうものであって、なにか特定の誘導がかかったときだけ、細胞質から核に移行する転写因子だったりするのかもしれません。

お礼

お礼が遅くなりました。

＞ひょっとすると、培養細胞で細胞質が染まり、核が染まらないのはそういうものであって、なにか特定の誘導がかかったときだけ、細胞質から核に移行する転写因子だったりするのかもしれません。

その可能性も否定できないですね。
それを確かめるためには、細胞質画分と核画分の蛋白をとってきてウエスタンする、などが妥当ですかね。
今度それも試してみたいと思います。
ありがとうございました。