- ベストアンサー
PCRの失敗について
Chicago243の回答
>PCRってちゃんと溶液を混ぜてもできないことあるん >ですか。 もう決まった条件があるのならまずうまく行かないことはありません。ですから試薬やサンプルに問題がある可能性が大です。 ただし、ちがうPCRマシーンをつかうと条件が変わってくる可能性があるので出ない場合は再検討してみることも考えたほうがいいことがあります。同じメーカで同じモデルでも機械が違うと違うとおっしゃる方もいます。 あとうまくいった時に使用したのと同じ種類のポリメラーゼを使ってますよね。それも確認した方がいいかもしれません。逆手にとって、手元に違う種類の酵素があれば使ってみるのも手かもしれません。たまにメーカーが間違ったプライマーを送って来ることがあるという話も聞いたことがあります。本当かどうかよく分かりませんが、メーカーの人に確認してもらうというのも必要なのかもしれません。
関連するQ&A
- PCRで複数のバンドがでます。
初歩的な質問ですいません。 PCRをしています。PCR産物を電気泳動すると、複数のバンドがでます。なぜでしょうか？ たとえば、100、200、300塩基の長さのバンドがでるとすると、これらはすべて、用いたプライマーによって増幅されたものなのでしょうか？それとも、プライマーの配列と完全に一致しなくても、このようなバンドがでるのでしょうか？
- ベストアンサー
- 生物学
- PCR法での失敗原因について
先日PCR法を用いてＤＮＡの複製を行ったのですが、電気泳動を行ってもバンドがまったく確認できませんでした。 原因としては唾の混入や皮膚の接触などが考えられたのですが、実のところ皮膚にはDNAを分解するだけの酵素が存在するのでしょうか？？ また皆さんがPCR法を用いたときに経験した失敗などがありましたら教えてくださいm(__)m よろしくお願いします。
- 締切済み
- 化学
- PCR＆電気泳動について
電気泳動について質問です。3種類のプラスミドDNAについて、同じプライマーを用いてPCRを行いました。このバンドを電気泳動してみたところ、2種類のプラスミドDNAに関してはクッキリと目的バン ドが出たのですが、残り1種類のプラスミドDNAの増幅産物にかんしては、薄い目的バンド➕スメアが観察されました。この原因として考えられるのは何でしょうか？自分が考えているのは、プライマーや酵素には問題がないと思うので(他2種類のプラスミドDNAのPCRはうまくいった。)、テンプレートのプラスミドDNAの精製度が低いと考えています。現にO.D値も1.72くらいだったので…。なので、プラスミドDNAの抽出からやり直そうかと考えています。 他に何か考えるべき要因があれば、ご教授お願いします！
- ベストアンサー
- 生物学
- PCR産物のゲル抽出・制限酵素処理後の電気泳動
大腸菌のゲノムからPCRで目的遺伝子を増幅し、アガロースゲル電気泳動にて目的位置にバンドが出ていることを確認した後、目的バンドを切り出してゲル抽出をしました。 その後、２種類の制限酵素で１晩処理し、アガロースゲル電気泳動にて泳動しましたところ、目的位置よりも高い（重い）位置にバンドが出ました。（(1)）PCR後にはなかったバンドで、PCR産物の泳動後のバンドより高い位置にあったため、酵素処理の切れ残り・切断のされすぎなどは考えられないかと思っています。 仕方がないので、非目的バンドを避け、目的のバンドを切り出してゲル抽出・エタノール沈殿を行った後、アガロースゲル電気泳動にて泳動したところ、やはり非目的バンドが(1)と同じ位置に出ました。 また、別の遺伝子を別プライマーを用いて、同じような作業でPCR・ゲル抽出・制限酵素処理（上記とは別の２種類）を行ったところ、やはり同じように高い位置にバンドが出てきてしまいます。 PCRに使用する鋳型のゲノムは同じ物を用いているので、ゲノムがおかしいのでしょうか？ そうだとしたら、PCR後に変なバンドが出ると思うのですが、PCR後には目的のバンドしか見えません。 このような場合、どのような作業が必要でしょうか？ 同じような経験がある方、是非教えてください。 追記：非目的バンドは、ちょうど目的バンド×２くらいの重さの位置に出てきています。 なんらかの形で２つがセルフライゲーションしてしまうことなどはあるのでしょうか？
- 締切済み
- 生物学
- PCR決定法について
PCRでは、増幅したいDNAの端の塩基配列がわかれば、それと相補的なプライマーを作るとよいというふうに授業で習いました。 では、既知配列の外側領域の塩基配列をPCRを用いて決定したい時にはどうしたらよいのでしょうか？ ーーーー「ーー」●○○○○○○●「ーー」ーーーー この「－－」の塩基配列です。 ○の塩基配列は●をプライマーとすれば決定できるのはわかるのですが、その外側の塩基配列の場合のことです。制限酵素とかで切ったりしてやるのかなぁとも思うのですが、よくわかりません。。
- 締切済み
- 生物学
- 「制限酵素によるDNAの完全な切断」の定義をおしえて下さい。
1) 制限酵素認識領域を含むDNAをPCRで増幅 ↓ 2) DNAを精製 ↓ 3) 制限酵素処理 ↓ 4) DNAを精製 ↓ 5) 4)をテンプレートとして1)と同じプライマーセットでPCR ↓ 6) 1),3),5)のサンプルを電気泳動でチェック というような行程で実験を行ったのですが、5)で1)と同様のバンドが検出されました。 これは、3)でDNAが完全に切断されていないということだと思うのですが、制限酵素の取説通りの「制限酵素によるDNAの完全な切断」を行うための操作しっかりと行ったはずです。 どなたか「制限酵素によるDNAの完全な切断」の定義をおしえて下さい。 よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- PCRプライマーへの制限酵素配列付加
こんにちは。いつもお世話になっています。 プライマー設計についてなのですが、 “制限酵素配列を付け加える場合は余分に数塩基追加した方が、制限酵素による切断効率が低下しない。” というのを聞いたのですが、実際に全く余分な配列を付加しなかった場合とではどれくらい差があるのでしょうか。 もしくは、全く付加しなかったプライマーでのPCR productを制限酵素処理し、ベクターに導入した際の効率はかなり下がってしまうのでしょうか。 ・・・というのも、大変お恥ずかしい話、今回PCR productをベクターに挿入する目的で制限酵素配列を付けたプライマーを設計したのですが、上記定義をプライマー作成後に聞き、もう一度作り直した方がいいのか悩んでおります。 基本中の基本のミスなのは重々承知の事なのですが、どなたかご存じの方がおられましたら、些細な事でも構いませんので教えて下さい。宜しくお願い致します。
- ベストアンサー
- 生物学
お礼
間違ったのを送ってきたのかもしれませんね。 問い合わせてみます。 結構長いプライマーなのでうまくアニーリングできていないかもしれないですね。 酵素はKODでうまくいっているので問題ないと思います。やっぱりプライマーが問題そうですね。 アニーリング部分が一塩基でも違うとアニールしませんよね？ 注文したプライマーがきちんとできていないと クレームをつけないといけないですが。 メーカーはちゃんと配列を確認してから送ってくるのでしょうか？