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PCRの失敗について
Chicago243の回答
- Chicago243
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なんとなくわかってきました。プライマーは使用経験があり、PCRがかかるハズのものなのにうまく行かないということですね。試薬、サンプル、条件のどれかがおかしいわけです。プラスミド(テンプレート)の量は1-10ngなら選択として悪くはなと思います。で、テンプレートはこのレベルではほとんど検出できないと思います。エチブロでDNAの検出感度は10ng弱です。PCRのエラーを防ぐためにサイクル数を減らすという目的で、もっとたくさんのテンプレートを使う人もいますが、今回は前の方がやった条件を再優先するのがいいかと思います。 まず簡単にできること。水を変えてください、新しくmiliQから取った水あるいはそれをオートクレーブかけたもの。もし同じ試薬でほかの人とかが使ってワークしているものがあれば分けてもらいましょう。あるいは新しいものをつかう(古いものも同時にやってOKであったら古い方から使っていけばいいわけです)。テンプレートはプラスミドのようですがほかに違うクローンから取った同じプラスミドはないですか?同時に何種類か使ってみましょう。 KODということですが、もしかしてバッファーは2種類なかったでしたっけ(なかったかもしれないです)?MgCl2フリーのバッファーだとMgCl2を添加しないといけませんよ。前のうまく行った方法でなにかほかに加えていませんでしたか?ベタインとかDMSOとか。まとにかくプロトコールの再点検ですね。 あとプライマーの濃度とか気にしているようですね。260nmの吸収で確認できますよ?詳しくは試薬屋さんのとかたろぐのAPENDEXとかをみれはどれくらいの吸収が得られるかとか書いてますので確認して見れはどうでしょうか。あとうまく行った時のデーターなどノートを取っていれば見せてもらうのもいいかもしれません。ホットスタートをするかしないかだけでも全く違ったりすることがあります。
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