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凍結切片に泡
マウスの胚(E11.5)の凍結切片の作製を行なっているのですが、顕微鏡で観察すると組織のところに泡が入っていて泡のある部分の組織が崩れたり、抜けてしまっています。包埋の条件は解剖後、4%PFAで4℃45分固定後15%, 30% シュークロース／PBSで置換した後、コンパウンドで包埋してドライアイス上で凍結しています。クリオスタットの庫内の温度は－20℃で切片の厚さは10μmです。包埋する時にコンパウンドには泡が入っておりません。また組織の周辺に泡は見られず組織の中にみられます。解決方法で考えられることがございましたら、よろしくお願いいたします。
- kuoyang100
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質問者が選んだベストアンサー
kudann2001さんやmilk_teaさん、両者のおっしゃる現象のどちらかが生じていると思われます。どちらの現象が生じているのか知りたいのであれば、全ての切片を観察してみて下さい。もし必ずしも組織内でないのなら、kudann2001さんのおっしゃる現象が生じているのでは。もしその場合、今後こうした現象の発生を最小限に抑えたいと言うのであれば．．．下記の製品を使用してください。 しかし、4%PFA, 45分って、、、短くないですか？浸透を考えたら、ハラに穴を空けるとかした方が良い様な気がしますね。
その他の回答 (2)
凍結切片を作製する場合、包埋時に固定や置換をする必要はないと思います。（染色時に固定する。） 組織内にできた泡は、おそらく組織中に余分にある水分が凍結時に凍って氷の結晶を作り、その後、染色時に氷がなくなってできた泡だと思われます。 固定・置換をせずに、そのままコンパウンドで包埋してみてください。 ただ、この場合、マウス胚の全体像の凍結切片の作製は、薄切に、ある程度のテクニックが必要になるかもしれません。 特に脳などは柔らかく、上手く切れないかもしれませんが、頑張ってください。
お礼
ご回答ありがとうございました。milik_teaさんがおっしゃるとおり、サンプルを生で切る方法もあるそうですね。また今後、このようなトラブルが続く場合、検討してみようと思います。
- kudann2001
- ベストアンサー率50% (4/8)
多分ですね。切片が溶けてスライドガラスにくっつく時に、切片とガラスの間に、空気が追い出されず残ってしまい、泡になっていると思われます。 それが原因だと仮定して話をしますが、この泡が出来ない様にするのは、凍結切片では難しいと思いますよ。胚全体の組織像が必要なら話は別ですが、普通は写真を撮りたい所だけ、綺麗な像が得られれば良いので、何枚も切って良い像を探すのが、一番妥当ではないでしょうか。
お礼
原因が推測でき、参考になりました。パラフィン切片に比べて凍結切片はトラブルが多くて大変です。ご回答どうもありがとうございました！
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お礼
ご回答ありがとうございます。どうも観察したところkudann2001さんのおっしゃられているような現象が起こっているのではと考えています。下記にあげていただいたような製品があることは知りませんでした。とても参考になります。ありがとうございます。サンプルは解剖時に頭・心臓にニードルで穴をあけています。固定はもう少し長くしたほうがいいのですが、免染のために出来るだけ固定は弱くしたいというのがうちのラボの先生の方針なのでちょっと変えられないのです。(固定が強くなると反応しない抗体があるらしい…。PFAは弱い固定液だと思っているんですが) 検討するときの参考にします。どうもありがとうございました！