凍結切片の脱水について

質問

昆虫の脳の凍結切片を作成しているのですが、きった切片を顕微鏡で観察すると組織が収縮してしまいます。
今のプロトコルは
脳の解剖後、4%PFAで4℃O/N、固定後10%スクロース/PBS 8ｈ、20％スクロース/PBS O/N、30%スクロース/PBS 8ｈで脱水した後、コンパウンドで包埋して液体窒素で凍結しています。
原因は脱水が不十分かと思うのですが、脳はスクロース溶液中で沈んでいることは確認しています。
逆に脱水が長すぎるのでしょうか？
うまくいく方法があったらぜひ教えてください。
お願いします。

回答No.2

suiran2 · ベストアンサー

昆虫の脳は切ったことはありませんが，ゼノパスやマウスの下垂体は切ったことがあります。マウスの胎児の脳は水分が多く切りにくいものでしたが，脱水に十分な時間を取ったように記憶しています。実験プロトコルは全く記憶にないのですが（ショ糖溶液かさえも記憶にない？），脱水の一番目の溶液も一度交換し，二番目の溶液は何回も溶液を交換しながら何日間かかけて徐々に脱水したように記憶しています。あまりに昔のことで記憶が曖昧で信頼性のない情報ですが何かの参考になりましたなら…

お礼

回答、ありがとうございます。
多分「徐々に脱水すること」が重要だと思います。
急激な脱水で、脳が収縮したと考えられるので。
でも、切片を切った後抗体で染色するのであまり何日も脱水できないですし、、、
脳を見て脱水されているかどうかの見極めができるくらい練習するしかなさそうです、、、

回答No.3

isoyujin

抗体を掛けるのが目的なら、生の凍結切片で十分では無いでしょうか？組織の変化も急速凍結なら問題ないと思います。

お礼

回答ありがとうございます。
そういうやり方もあるんですね。
私はまだ凍結切片を学びたてなので、よくわからないのですが勉強になりました。

回答No.1

isoyujin

包埋後の凍結ですか？
包埋したままではいけないのでしょうか？
あるいは生を凍結切片では・・・？