凍結切片の作成方法

質問

GFP(緑色蛍光たんぱく質)の発現を観察するために、凍結切片を造りたいのですが、以前行ったときにひどく収縮してしまいました。

多少の変化は仕方ないと思っていますが、改善策はないでしょうか？

以前の作成方法は、組織片1cm3くらいを無処理で、直接液体窒素に投入し、その後-80℃に保存し、-20℃のクライオスタット内で金属製の台に包埋剤で固定し、少し厚めに切り、スライドグラスに載せ、室温で乾燥させ、そのまま蛍光顕微鏡で観察しました。

固定をするとGFPが失活してしまうと思うので、固定はできないと思います。インターネットで調べてみると、シュークロースで処理して凍結するとか、スライドグラス上ですばやく乾燥させるとかで改善できるのかな？？？などと想像しているのですが・・・いかがでしょうか？

アドバイスお願いします。

回答No.2

noname#13872 · ベストアンサー

凍結過程で試料が変形or収縮してしまうのを防ぐには30%シュークロースに漬けるといいです。
ただ、いきなり30%ではうまく浸透しないかもしれないので、
10,20,30%と段階的にした方が良いかもしれません。

乾燥過程で試料が変形or収縮してしまうのを防ぐのは難しいですが、
PBS:グリセリン=1:1の溶液でカバーガラスに封入しておく方法がお勧めです。(要は乾燥させない)
スライドグラスの上に載った試料にPBS/グリセリンを滴下し、
カバーガラスを載せてマニキュアのトップコートで四辺をカバーし、乾燥を防ぎます。

あと、砂糖漬けにした試料を蟻が持っていく事が多いので注意してください。

お礼

時間がなかったので、今回は細胞凍結用のセルバンカーに浸漬した後凍結してみました。
まだ切ってはいないので結果は・・・？
シュークロースの方法は次回試してみたいと思います。
封入するときはPBS:グリセリン=1:1の溶液で行う方法を試してみたいと思います。

有意義なアドバイスありがとうございました。

回答No.1

MIYD

マニュアルでは4％PFAで固定しても失活しないそうですが試されましたか？
ICCではよく使われています。

またはGFPを使う利点のひとつに細胞が生きたまま観察できるというのがあるので
クリオスタットでスライスした後で乾燥させずに生で写真は取れないのでしょうか。
組織によるのでしょうが
固定が甘いと乾燥時に細胞(組織内の構造？)ごとに収縮率が違うのかひび割れて
写真に撮るのに耐えられないときがありました。

後はがっちり固定して抗GFP抗体を使うという手もありますがそれならばFLAGやHAの方が見やすいそうですね。

お礼

４％PFAでの固定も乾燥させずに標本にしたこともありません。
固定の方は時間がないので次回試してみようと思います。
乾燥させないで標本にする方法は今回試してみたいと思います。

有意義なアドバイスどうもありがとうございました。