細胞診のプレパラート上で抗体抗原反応をさせて蛍光発光させたいのですがうまくいきません。

質問

現在、細胞を凍結スライスなどでスライドグラスに固定するのではなく、細胞をホモジナイザーなどで軽く潰して、トリプシンでバラバラにして、スライドグラスに固定させて、抗体抗原反応を行おうとしております。

しかし、スライドグラスにタンパク質固定用のSIGMAのポリプレップを使っておりますが、ぜんぜん張り付きません・・・

しかも、PBS中の細胞をスライドグラスに載せて、風乾させている最中に顕微鏡で見ていると、乾いてしまうと格子状の模様がでてしまって（肉眼で白く乾いた状態）、全然ダメです。
そこで、完全に乾いてしまう前に、グルタルアルデヒド固定を行ってみましたが、うまくいきません。

細胞をバラバラ状態で、スライドグラスに固定させるコツというのはあるのでしょうか？ご教授よろしくお願いいたします。

回答No.1

Fiorina · ベストアンサー

細胞によりますが張り付けるのはかなり難しく、抗体反応の
洗浄過程などではがれてしまうことが多いですね。まず、
その細胞は培養することは可能ですか？培養用のスライド
ガラスで２、３日培養するとしっかり張り付くこともあります。
また、６wellプレート等に滅菌したカバーガラスを入れて
その上で培養し、固定から染色までを行う方法もあります。
この場合は、染色作業の終了後にスライドガラスに載せます。
とにかく、染色操作では細胞がはがれ易いので細心の注意が必要です。
この他に、細胞をばらばらにした状態でマイクロ遠心チューブ内で固定
して染色操作を行い、染色終了後にそっとガラスに載せる方法も
あると聞いたことがあります。

お礼

ご教授ありがとうございました。

あれからいろいろ検討した結果、下記のことがわかりました。

・切片が薄ければ薄いほど、コントロールの蛍光が抑えられる。
・プライマリーカルチャー＞株細胞のような蛍光発光傾向がある。
・IR域で撮影する。
・スライドグラスのコートをいろいろ試す。
・蛍光を700nm領域の物に変える。

特に、プライマリーカルチャー＞株細胞の関係が大きいようで、自分のサンプルは、ほんとうに稀に見るほど自家蛍光が強いということでした。

補足

いつもご教授ありがとうございます、Fiorina様。

今使っている細胞は、アサリの外套膜を単純に潰しておりまして、まだ完全にバラバラになっていない状態では、スライドに付くのですが、バラバラにするとスライドに付かない状態です。

スライドチャンバーで培養してからやる方法も検討してみようと思います。細胞をばらばらにした状態でマイクロ遠心チューブ内で固定して染色操作というのもやってみようと思います。

もう一つの問題点なのですが、塊りの細胞を載せた場合に、コントロールもサンプルも蛍光発色をしてしまって、差が出ないのです。コントロールの細胞が、ほんのり光ってしまっていて、サンプルも同じ光方をしています。

このような問題に当たったことはありますでしょうか？初心者質問で申し訳ございませんが、よろしくお願いいたします。

回答No.4

bunnosukehina

病理を主にやっているものです。
細胞診などでよくコーティングスライドを使いますが、そのようなものはダメですかね?
ポリ-L-リジン、シラン等が有名で、松浪ガラスのMASコートスライド等は液体でも結構使えますよ。
固定法に関しても、アルコールスプレーで迅速固定するものなど、いろいろ出ていますので利用しています。
集細胞遠心機(サイトスピン)があったら、細胞が確実に張り付くので、有効だと思うんですが。
培養細胞に関してはほとんど経験がないんで、できそうな方法を書いてみました。

お礼

ご教授ありがとうございました。

あれからいろいろ検討した結果、下記のことがわかりました。

・切片が薄ければ薄いほど、コントロールの蛍光が抑えられる。
・プライマリーカルチャー＞株細胞のような蛍光発光傾向がある。
・IR域で撮影する。
・スライドグラスのコートをいろいろ試す。
・蛍光を700nm領域の物に変える。

特に、プライマリーカルチャー＞株細胞の関係が大きいようで、自分のサンプルは、ほんとうに稀に見るほど自家蛍光が強いということでした。

補足

ご教授ありがとうございます。

> 細胞診などでよくコーティングスライドを使いますが

SIGMAのポリプレップもいわゆる、コーティングスライドなのですが、つかないのですよ。通常のスライドグラスも使ってみたところ、なにも違いがなく、不思議に思ってしまうほどでした。

ポリ-L-リジンを使って自分で一旦、細胞の電荷を変化させてとも思ったのですが、肝心なポリ-L-リジンがなく・・・この方法は手に入れたらやってみたいと思ってます。

> アルコールスプレーで迅速固定

これはとても便利そうですね。こういう便利な物があるとは知りませんでした。

いろいろとありがとうございました。

回答No.3

cherry88

私は今までスライドチャンバーで培養してからPermiabilization処理をしてきましたが剥れる事はマレでした。培養はいっぱいの細胞を最初に入れておけば一晩から１日で大丈夫じゃないかな！？　っま、細胞の種類によるからこればっかりは試してみないとね。多分抗体抗原反応もすべてチャンバー内で行います。注意としては、チャンバー内で抗体抗原反応をするときチャンバーから隣のチャンバーへの漏れに注意してください！コントロールも台無しになります。

お礼

ご教授ありがとうございました。

あれからいろいろ検討した結果、下記のことがわかりました。

・切片が薄ければ薄いほど、コントロールの蛍光が抑えられる。
・プライマリーカルチャー＞株細胞のような蛍光発光傾向がある。
・IR域で撮影する。
・スライドグラスのコートをいろいろ試す。
・蛍光を700nm領域の物に変える。

特に、プライマリーカルチャー＞株細胞の関係が大きいようで、自分のサンプルは、ほんとうに稀に見るほど自家蛍光が強いということでした。

補足

ご教授ありがとうございます。
初代培養すらしたことない細胞なので（サンプルはアサリの外套膜）、スライドチャンバーは最終方法にしようと思ってます。
スライドチャンバー使用時の注意項目などありがとうございました。

回答No.2

Fiorina

>塊りの細胞を載せた場合に、コントロールもサンプルも蛍光発色をしてしまう....

理由は思い当たりませんが、私も何度も経験したことがあります。
組織によっては切片でもコントロールが蛍光を発することがあります
が、そういう場合は(素直に)DAB発色に切り替えています。ご存知かも
しれませんが、塊のままでいわゆるホールマウントに近い方法が
使えるかも知れません。組織ごとチューブ内でDAB染色まで行い、
観察時にスライドガラスに載せる方法です。この場合、抗体の浸透が
問題となりますので、低濃度のジギトニンやTriton, Tween等を用いて
permiabilization処理を行います。この時の条件は、抗原の保持状態
にも影響しますから、一概にどの条件とも言えず、色々試してみる他
ありません。また、固定液や抗体の浸透不足が起こりえるので、
組織内部を染めるポジコン染色を同時に行う必要があります。

補足

ご教授ありがとうございます、Fiorina様。

試しに今日も蛍光発色でやってみたのですが、うまくいかないので次はＤＡＢ発色に変えてみます。少し古いＨＲＰ標識2次抗体しかないので、うまくいくのか心配ですが。

> 塊のままでいわゆるホールマウントに近い方法

これがいいのかもしれませんね。これもやってみようと思います。