• 締切済み

蛍光抗体法でホルマリン固定の組織を見ることは可能か?

一般的に蛍光抗体法で観察できる組織というのは凍結切片だと思いますが、抗原賦活化を行ったホルマリン固定のパラフィン切片で観察することは可能でしょうか?免疫染色・イメージングのコツという本にはホルマリン固定だと、バックグラウンドが出やすいが蛍光抗体法で観察することができないことはなさそうに書いていたので質問させていただきました。

みんなの回答

  • otx
  • ベストアンサー率44% (256/576)
回答No.2

可能です。 一次抗体の特性によります。 しかし、使えるものは全く問題ないです。 条件検討などは他の免疫染色と同じようにする必要はありますが。

hatoking
質問者

お礼

やはり、一次抗体次第なんですね。 勉強になりました。ありがとうございました。

  • Dr_Hyper
  • ベストアンサー率41% (2482/6031)
回答No.1

抗体によるという条件付きですが可能です。 抗原賦活化の条件、ブロッキングの条件検討は必要となりますがキレイに染まりますよ。 市販の抗体のカタログをぱらぱら見てもらってもパラフィン切片でも染色可能と載せてある抗体もありますので。 ご参考までに。

hatoking
質問者

お礼

早速の回答ありがとうございました。自分が使用している抗体では同条件でも結果にかなりばらつきもでています。 他の抗体も参考にさせていただきます。

関連するQ&A

  • 【免疫組織化学】同じ一次抗体、組織について複数の検出法を用いましたが結果が統一されません

     はじめまして。  現在、私はマウス小腸の神経内分泌細胞に発現する【とある神経伝達物質(以後SやGと略)】を検出するべく、免疫組織化学的実験法(IHC)を複数種類検討しています。  そして、この実験中に問題が発生しました。  検体、一次抗体が同一であれば、どのような検出法を用いても染まり方は同じですよね??  しかし検体、一次抗体等の条件が統一されているのにも関わらず、染まる細胞数や染まる細胞の部位が統一されません。  検出法には、  (1)【Alexa488標識二次抗体を用いた蛍光抗体法】  (2)【SABC法を用いたCy3による蛍光抗体法】  (3)【LSAB法によるDAB染色】  をそれぞれ用いています。  一次抗体を添加しないといったようなネガティブコントロールを確認してみても、内因性ペルオキシダーゼやビオチンによる非特異的な染色は見られません。  私自身のIHCの技術獲得の為にも、それぞれの結果が統一できなければ、実験が先に進みません。  IHCにお詳しい方、どうか御知恵を拝借させて下さい。  どうかよろしくお願いいたします。  以下、備考 ・パラフィン切片 ・賦活化にマイクロウェーブ ・一次抗体の濃度は一定(濃度条件検討済)

  • EDTAによる抗体賦活化を行うと切片がはがれてしまうのですが…

    現在、免疫染色を行っています。 私はパラフィン切片を用いているのですが、EDTAによる抗体賦活化を行うと切片がはがれてしまいます。 クエン酸バッファーではシグナルが出ず、EDTAの方が自分の染めたいものに関しては感度がいいようなのでどうしてもEDTAで行いたいのですが。。 方法は、薄切後、37℃インキュベーターでover nightしたパラフィン切片を脱パラ、流水水洗後、1mM EDTA中に入れ、オートクレーブで120℃15分加熱処理しています。 スライドガラスはMASコートを用いています。 どこか悪いところがあるのでしょうか?

  • 免疫力賦活化と抗体

    免疫について勉強しています。 それで、免疫賦活化の指標として抗体の産生量を調べている実験を目にしたのですが、その抗体は一体何を抗原として産生されたものなのでしょうか? 私は、その免疫を賦活化をさせると言っている物質を排除しようとして抗体がでているだけなのではないかと思ったのですが、どうなのでしょうか? それでも免疫賦活化になるのでしょうか? よろしくお願いします。

  • 固定した組織のウエスタンブロット

    動物に起炎物質を投与してそこで発現する蛋白の免疫染色を行っています。しかし凍結切片を作製して染色してもうまく染めることができません。起炎物質の失活か、投与ミスか、あるいは抗体が古いためにラベルが外れたのか、発色工程に問題があるのか原因が不明です。 そこで、固定ずみの凍結切片(4%PFA、OCTで包埋済み)をブロックから切り出してウエスタンで目的のものを確認できないかと考えていますが、一度固定した組織片をミクロトームで薄切し、その薄切片をSDS/DTT存在下でsonicationあるいはboilなどで可溶化し、目的蛋白の発現を確認することは可能でしょうか?固定しているので、もはや可溶化することはできないでしょうか? Vehicle投与群と起炎物質投与群の間で差があれば、再度免疫染色を再検討しようと思うのですが。ご経験のある方のご意見がいただければ幸いです。

  • 免疫組織染色

     医学部大学院生ですが、免疫組織染色で悩んでいます。 やり方は色々書いているのですがさっぱり・・・です。まず、還流固定で取り出した臓器をどのように保存しておくのが良いでしょうか?凍結保存ですか?それともパラフィン固定でしょうか?パラフィン固定するその前に4%?10%? パラホルムアルデヒドで保存?免疫組織染色する前に長期間保存しておくにはどのような方法が良いでしょうか?

  • 間接蛍光抗体法 2

    続いておおしえください。 FITC標識した二次抗体で蛍光顕微鏡観察しますが、ビオチン標識した二次抗体にストレプトアビジンをつけて観察する場合、やはり蛍光顕微鏡が必要なのでしょうか。 当方、蛍光顕微鏡がないので、ひょっとしたらストレプトアビジンは酵素抗体法であり可視光観察できるのかと思っていましたが。 また、ストレプトアビジンは大変高価ですが、通常のFITCでの蛍光観察よりも、感度が随分優れているのでしょうか。 よろしくご教示ください。

  • 脱パラしただけなのに蛍光で光ってしまいます。

    脱パラしただけなのに蛍光で光ってしまいます。 パラフィン切片を脱パラしただけの状態の組織切片を蛍光顕微鏡で見ると、なぜか組織の一部が光ってしまいます。蛍光抗体もかけていないのに何が原因なのでしょうか?

  • 免疫染色でシグナルが出ない。。

    2種類の別の抗原を認識する抗体で、卵巣を凍結して免疫染色を行いましたが、シグナルがみられません。。 -80℃の2-メチルブタノールで凍結後、切片を作製、アセトン固定後免染を行いました。 免染自体は、みな同じプロトコールなので問題ないと思います。 論文を参考に新しく抗体を買った(その論文では製造会社までしか指定がなく、型番までは不明)ので、失活していることはないはずです。 ただ、論文に書いてあった抗体候補は複数あり、違う抗体を買ってしまった可能性もあります。 最初、2次抗体を蛍光のものを用いたのですが、全体が薄く染まり、特異的なシグナルが見られませんでした。 そこで、ABC染色によりビオチンを介したのですが、本来でるはずのところには見られず、細胞がポツポツと卵胞の周りで染まっているだけでした。 抗体濃度は、データシートのスタート濃度でやっています。 この場合、次に何を試してみればいいでしょうか?? 抗体の賦活化はまだやったことがないので、次やってみようかと思っていますが、今回の結果で特異的に全くでていなかったので望み薄のようですが。。。 シグナルが出ない場合はみなさんはどのようなことを試すのでしょうか? 何か他に書いた方が答えやすいとのアドバイスもあれば、お願いします。

  • ウニ卵の細胞固定、組織染色について

    実験でウニ卵の組織染色をすることになりました。凍結して、組織断片をつくり、免疫染色を行ったのですが、きれいな切片ができません。固定後、20%スクロースにつけると、浸透圧の変化に影響されないという情報があるのですが、詳しいプロトコルを教えてください。

  • rabbitで作られた2種類の一次抗体でで組織切片に対して二重免疫染色

    rabbitで作られた2種類の一次抗体でで組織切片に対して二重免疫染色をしたいのですが、どのような方法があるでしょうか?