• ベストアンサー

PAS染色のための組織

お世話になります  GFPマウスからの組織をPAS染色したいと思っていますが、パラフィンや新鮮凍結ではGFPが流れてしまうことが多いので灌流固定後、4%PFAそしてシュクロースそしてOCTコンパウンドにてブロックを作っているのですがその切片を切った後のPAS染色を行いたいのですがどのような手順を行えばよいかご教授いただきたく思います。(われわれの研究室は小さくこのような手順を行った方がいらっしゃらないので質問させていただきます よろしくお願いします)

質問者が選んだベストアンサー

  • ベストアンサー
回答No.1

Cryosectionでしたら、基本的にパラフィンセクションと同じ方法で可能だと思います。 ただ、染色強度には差が生じるかもしれませんので、 その点、いくつか条件を振られた方がいいと思います。

関連するQ&A

  • 脂肪細胞の染色について

    脂肪細胞を染色したいのですが、通常のパラフィン切片ではだめなんですよね。 硬組織なのですが、凍結切片にしないで行う方法を教えてください。 よろしくお願いいたします。

  • 免疫組織染色法の結果について

    同じパラフィンブロックから薄切された切片を、同じ実験方法を用いて免疫組織染色した場合、結果が異なる(染まるor染まらない)ことがあるのでしょうか? また、あるとすればどういったことが考えられるのでしょうか? 私の場合、以前行った実験では染まり、今回行った実験では染まらないという結果になってしまい当惑しております。 免疫組織染色の初心者ですが、ご教授下されば調べて理解に努めますので、よろしくお願いします。

  • 免疫組織染色

     医学部大学院生ですが、免疫組織染色で悩んでいます。 やり方は色々書いているのですがさっぱり・・・です。まず、還流固定で取り出した臓器をどのように保存しておくのが良いでしょうか?凍結保存ですか?それともパラフィン固定でしょうか?パラフィン固定するその前に4%?10%? パラホルムアルデヒドで保存?免疫組織染色する前に長期間保存しておくにはどのような方法が良いでしょうか?

  • クリオスタット 薄切 HE染色 耳組織

    クリオスタットによる凍結マウス耳組織の薄切を試みているのですが問題として、 薄切してコートガラスにはり付けた組織を顕微鏡で観察すると、ほとんどが軟骨に沿って裂け目(組織のない空間)が出来てしまっています。 切り出すときに予め粘着フィルムを凍結組織にはり付けておいてフィルムにはり付いた状態で切り出せる方法も試してみましたが、HE染色後に観察したところ、やはり軟骨に沿って裂けたような空間が出来ていました。 何か耳組織の形状を崩さずに上手く切り出すコツのようなものがありますでしょうか? 以下に実験条件を記させていただきます。 凍結組織は先生に作製していただいており、未固定でOCTコンパウンドを使って包埋したものです。液体窒素凍結したものを-80℃で保存しています。 薄切条件は-15℃、10 μmで速くない程度のスピードで極力しわや丸まりを避けるようにシート上で切り出し、剥離防止コートスライドガラスを真上から下ろして吸着させています。 染色操作はスライドでの染色の場合は、1時間冷風で乾燥させた後、4% PFAで10分固定化し(流水5分)、ヘマトキシリンを2分(流水20分)、エオジンを10秒(流水数10秒、EtOH数10秒、水浸け置き)接触させています。 フィルムにはり付けた状態で切り出して染色する場合は、最初の処理が10秒程度室温で融解させた後、EtOH10秒、4% PFA1分にフィルムを浸して固定化しています。後の処理は同様です。 もう一点質問させていただきたいのですが、 スライドガラスに薄切した組織をはり付けた後、融解乾燥させずにすぐにEtOHに1分浸け、水洗い後ヘマトキシリンで染色するというプロトコルがあるのですが、これを実践したところ水に浸けるとすぐに組織が剥離してしまいます。EtOH中でも剥離しそうになっています。 乾燥させない方法でEtOH中や水中で剥離しにくくするコツなどは何かありますでしょうか? 記述不足があるかとは思いますがご指導の方何卒宜しくお願いいたします。

  • 固定した組織のウエスタンブロット

    動物に起炎物質を投与してそこで発現する蛋白の免疫染色を行っています。しかし凍結切片を作製して染色してもうまく染めることができません。起炎物質の失活か、投与ミスか、あるいは抗体が古いためにラベルが外れたのか、発色工程に問題があるのか原因が不明です。 そこで、固定ずみの凍結切片(4%PFA、OCTで包埋済み)をブロックから切り出してウエスタンで目的のものを確認できないかと考えていますが、一度固定した組織片をミクロトームで薄切し、その薄切片をSDS/DTT存在下でsonicationあるいはboilなどで可溶化し、目的蛋白の発現を確認することは可能でしょうか?固定しているので、もはや可溶化することはできないでしょうか? Vehicle投与群と起炎物質投与群の間で差があれば、再度免疫染色を再検討しようと思うのですが。ご経験のある方のご意見がいただければ幸いです。

  • ゴルジ染色の方法

    サンプルは、マウス脳(4%パラホルムアルデヒド灌流固定)の脳を用いてデンドライトやスパインを観察する目的です。「新染色法のすべて」に書かれている手順に従ってやってみようとしているのですが、セロイジンの取り扱い方が解りません。 1)クロロホルム・70%アルコールで硬化させる方法がわかりません。 2)硬化するとパラフィンのような固さになるのですか? 3)そのときの容器は何を使うのですか。 4)包埋された物体をどのようにして滑走式のマイクロスライサー(ミクローム HM430)に固定するのですか。 5)70%アルコールを付けながら切片を作製するとはどういう事でしょうか。 6)切片作製用の刃は、パラフィン切片作製に用いている品番(FEATHER S35)でいいのでしょうか。 7)切片が切れたとして、いつの時点でスライドガラスに張りつけるのでしょうか。 よろしくお願いします。

  • マウス胎仔脳の染色法について

    マウス胎仔脳の新鮮凍結切片を用いて免疫染色を行っています。後固定に4%PFAをもちいてますが、かなりの確率で脳組織が脱落してしまいます。 スライドガラスはAPSコーティングのガラスを使用しています。脳組織の脱落を防ぐ良い知恵をお借りできないでしょうか?

  • 凍結包埋ブロックの組織からゲノムDNAを抽出したいのですが

    以前に、マウスの腎組織を採取し、それをOCTコンパウンドで包埋した後、 液体窒素で凍結して新鮮凍結組織ブロックを作りました。 今回、このブロックの腎組織からゲノムDNAを抽出したいのですが、 まずOCTコンパウンドの除去をどのようにすれば良いのか迷っています。 単純に凍結状態でメス歯などで腎組織部分のみを切り出せばよいのか、 ブロックを融解させて腎組織を取り出し、緩衝液でコンパウンドをすすぎ落とせば良いのか。。。 できるだけ良質なゲノムDNAを抽出したいので、どなたかプロトコル、書籍・論文等の参考文献、経験上のアドバイス・注意点などを教えて頂けると助かります。 どうぞ宜しくお願い致します。

  • 凍結切片に穴ができる

    脳の凍結切片を作成して免疫染色を行ったのですが、切片に細かな穴がたくさん開いていて見栄えがとても悪いです。どこが悪かったのでしょうか? 作成方法は、4%PFAで灌流固定後、全脳を4℃で後固定O/N 30%スクロース/PBSに置換して4℃、O/N(沈むまで) OCT Compoundで包理後、ドライアイスで急速凍結して-80℃保存 使用時に-20℃で安定化後、切片作成しました。 切片に穴があく場合、どこを直すor改善すればよいのでしょうか。 よろしくお願いします。

  • ウニ卵の細胞固定、組織染色について

    実験でウニ卵の組織染色をすることになりました。凍結して、組織断片をつくり、免疫染色を行ったのですが、きれいな切片ができません。固定後、20%スクロースにつけると、浸透圧の変化に影響されないという情報があるのですが、詳しいプロトコルを教えてください。