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※ ChatGPTを利用し、要約された質問です（原文：タンパク質の活性がなくなってしまう）
タンパク質の活性がなくなる原因と解決策
このQ&Aのポイント
- タンパク質の活性がなくなる原因は、蛍光標識手順におけるNaCl濃度の影響やバッファーの組成によるものです。
- タンパク質の活性低下を防ぐためには、標識手順において適切なNaCl濃度を設定し、バッファー組成にも注意する必要があります。
- また、活性保護のために実験条件を制御し、バッファー交換や洗浄時にも室温下で行うことが重要です。
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アミノ基に結合させると言う話ですが、N末のアミノ基ですか？それとも、リジン残基のεアミノ基ですか？ もし、N末だけのラベルで検出出来るなら、それにこしたことはありません。 でも、ラベルで活性がなくなるということは、リジンの可能性が大ですね。アミノ基のようなプラスチャージがタンパク表面に出ている部分は、核酸とイオンペアー（あるいは水素結合）を作る重要な残基の可能性が高いので、出来れば他の残基に変えられてはどうですか？システインがあれば、それを利用する（無くてSDMで作る）のが良いと思います。でも、N末のみの修飾（反応pHを制御すれば出来るはず）で Cy3とかローダミンなら明るいから、いけるような気がします。 実験で、核酸で保護しているつもりでしょうが、基本的に結合は揺らいでいるので、くっついたり離れたりを部分的に繰り返しているので、反応時間が長いと修飾が入ると思います。
お礼
大変専門的な回答を本当にありがとうございます！！ラベリングはリジンのアミノ基で行っています。実はもう1つ同じような方法で別の色素でも標識しており、２つの色素によるFRETを予定しているため、できれば現在しようしている色素で成功させたいという思いです。。。 結合のゆらぎのことは全く考えていませんでした！ぜひ、反応時間のことを検討して再度挑戦してみたいと思います。 ありがとうございました。