TLCによるリン酸化タンパク質の展開とは？
- TLCを用いたリン酸化タンパク質の展開について、実験方法とその結果について質問しています。
- 実験では、protein kinase Aのリン酸化活性を調べるために、phosphataseを発現させた細胞からAを免沈した画分と、Aの基質であるタンパク質Bを32P-ATP存在下でincubateしました。
- TLCで展開した結果、phosphataseと共発現した場合には、Bのリン酸化バンドが強くなりました。そのため、phosphataseがAの活性を調節している可能性があると考えられます。
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TLCによるリン酸化タンパク質の展開・・・
当方、TLCのを用いた実験に慣れ親しんでおらず、論文に記載されている実験のイメージがわきません。下記のような内容だと思うのですが、どなたか詳しい方がいらしたら、こういう実験方法が存在するのかどうなのかを教えていただきたいと思い、質問いたしました。脂質だけでなく、タンパクも展開されるんでしょうか・・・(化学の知識が貧困でして、お恥ずかしい質問かもしれません)。 ＜実験内容＞ あるprotein kinase(仮にA)にリン酸化活性があるかどうかを調べるため(phosphataseと共発現したときの影響を見ようとしている)、phosphataseを発現させた細胞からA抗体で内在のAを免沈した画分と、Aの基質となるタンパク質(仮にB)を32P-ATP存在下でincubateした。 これをTLCで展開したところ、コントロール細胞を用いたものでは原点から離れた位置にBのリン酸化バンド(？)が確認されなかった。一方phosphataseと共発現させたものでは、Bのシグナルが強くなった。 このphosphataseはAとassociateすることが分かっているので、おそらくAを脱リン酸化、あるいはAをリン酸化しに来る上流のkinaseを脱リン酸化することで、Aの活性を調節しているのだろう・・・ 多分こんな内容だと思います。あえてTLCを用いるメリットってあるんでしょうか？Bを基質にしたin vitro assayとかでもいいんじゃないかと思うのですが・・・。
- toukitirou
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TLCで行うと、シンチレーションカウンターにかけなくてすむので楽ですよ。
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