リン酸化タンパク質の細胞内機能解析について

質問

スクリーニングしてきたリン酸化タンパク質の細胞内機能について知りたいのですが、リン酸化されるという報告のあるタンパク質の組換えタンパク質を作成または購入し、タンパク質導入試薬を用いて細胞に導入したら、この組換えタンパク質は細胞内でリン酸化されるのでしょうか？特異的なkinaseの活性があればリン酸化されると思うのですが。

また、試験管内で組換えタンパク質をリン酸化させる方法はありますか？

回答No.2

tomi-chan

再び補足をお願いいたします。スクリーニングしてきたタンパク質とは、従来のどのサブファミリー / サブタイプの PKC の基質となるかわかっているのでしょうか？　組換えタンパク質は、野生型とどのように異なるのでしょうか？

PKC との基質特異性が保証されていて ATP および PKC活性化因子の種類と量が適切なら、それが「細胞内」であっても in vitro であってもリン酸化されると思うのですが、それを細胞に「注入」してリン酸化させることができたとしても、そのことが情報伝達において、どのような意味を持つのかを証明することはできないと思います。要素として情報伝達を担う分子を細胞膜内に注入しても、情報伝達「系」の外にある状態では、その反応は「かやの外」である可能性があります。

回答No.1

tomi-chan

お役にたてるかどうか自信がないのですが、いくつか教えて下さい。リン酸化タンパク質とは自己リン酸化活性をもつタンパク質という事ですか？　組換えタンパク質導入は、Loss of function を意図したものですか？　それとも細胞に組換えタンパク質を直接マイクロインジェクションにより「注入」するということですか？

katamasaさんの実験の目的を伺わずに推測でお話しして恐縮ですが、自己リン酸化活性をもつタンパク質が、リン酸化カスケードのうちのどの部分の役割を担っているのかお知りになりたいなら、放射性同位体P32を使って、オートラジオグラフィーで同定するのが良いと思います。

自己リン酸化活性をもつタンパク質は、同時にATPase活性を持つものが多いので、in vitro で自己リン酸化活性を検証する時は ATP要求性にも注意が必要です。また、これがレセプターである場合は、リガンド存在下でないと自己リン酸化しません。

補足

ご回答ありがとうございます。

リン酸化タンパク質とは、PKCなどのkinaseによりリン酸化されるタンパク質のことです。また、組換えタンパク質導入は、「注入」し、細胞内での量を増加させるという意味です。

私の実験の目的はこのタンパク質のリン酸化体が増加した場合に、細胞にどのような影響をもたらすのか明らかにすることです。

助言がありましたら、書き込みを宜しくお願いします。