腫瘍細胞にタンパク質を過剰発現するやり方

質問

初めて質問します。
21歳の医学部生です。
いま実験を行っていて、B16メラノーマという細胞にIRAK-1とIRAK-4というふたつのタンパク質を過剰発現させたいのです。
ネットで探したところ、目的のタンパク質のDNAの相補的DNAをベクターに組み込んでそれを腫瘍細胞に形質導入するという方法を見つけたのですが、それで、過剰発現させることができるのでしょうか。
また、たった区別の方法があるのでしょうか。

基本的な質問ですみません。回答をよろしくお願いします。

回答No.2

yuklamho · ベストアンサー

『目的のタンパク質のDNAの相補的DNAをベクターに組み込んでそれを腫瘍細胞に形質導入するという方法を見つけたのですが、それで、過剰発現させることができるのでしょうか。』
pcDNA3.1 (Invitrogen)などの薬剤耐性遺伝子を含む発現ベクターに目的の遺伝子を組み込んでLipofectamin (Invitrogen)やFuGENE (Roche)などの試薬を使って細胞に導入する方方が一般的です（した）が、今はレンチウイルスにパッキングして細胞に導入する方が効率が良いのでそちらを好む人が増えています。

二種類の遺伝子を導入する場合は、一度にやれないこともないけれど、まず、片方を導入してポジティブな細胞を拾い、それにもう一つの遺伝子を導入するのがよいのではないでしょうか。

遺伝子を細胞に導入した後は培地にピューロマイシンなどの薬剤を入れて目的の遺伝子の入っていない細胞を殺し、残った細胞のコロニーをピックアップして一部をPCRやウエスタンブロッティングで目的の遺伝子が入っているかどうか確認できます。

お礼

非常に丁寧でわかりやすいご説明ありがとうございます。
ベクターを細胞にtransfectionかtransductionで入れるかも迷っていたのですが、yuklamhoさんのおっしゃった方法でやってみます。本当にありがとうございました！

回答No.1

larme001

医学部の何年生なのかわかりませんが、2年生ぐらいなら基本的な細胞生物学ぐらいはすでにやってるでしょうからもう少し論理的な文章は書けないのかなあと思います。無論、実験を全くやったことがないなら細かい技術とかはわからないかもしれませんがあまりにも科学者らしくない表現が目に付きます。医学部（医学科）の学生ならもう少し専門家になることを意識した表現を使うべきでしょう。
　例1：　B16メラノーマという細胞、、、、⇒メラノーマ＝悪性黒色腫（いわゆるほくろのがんです）よね、つまりB16メラノーマという細胞＝B16悪性黒色腫という細胞って日本語として不自然かなあとも思うんですよね。
例2: 目的のタンパク質のDNAの相補的DNAをベクターに組み込んで...=DNAはDNAですし、そもそも「通常は２本鎖で存在するデオキシリボ核酸」のことをいうわけですから「タンパク質のDNAの相補的のDNAをくみこんで」という表現は少し不自然でしょう。DNA plasmid（ここでいうベクター）の転写される向きのことをいっているんだとしても普通に考えて相補的云々が出てくること自体そもそも基本的な内容があやふや。

学生だったとしてもそのへんの表現っての自体がそもそも「科学的な思考ができるか」というものにも関わってくるので、意識した方がいいと思いますよ。別に揚げ足取りがしたいわけではありませんよ。

　というわけで、ご質問に答えようとすればまあプラスミドDNAをリポフェクションだったりウイルスベクターで入れるなりなんなり答えることはできますが（色々な事を考えるとまあB16細胞だったら可能ならレトロかレンチウイルスが第一選択でしょうが）、ご指導していただいている先生とかラボの学生とかに指示を仰いだ方がよろしいかと思いますけどね。もし「自分で考えてまとめてこい！」って言われたんだとすると医学部の学生がこんなところで初歩的な質問してないで図書館とかで勉強したほうがいいと思います。

どうしても特別な事情があるのかもしれませんが、近い将来「先生」になる人がこれでは少し残念なんですが、、、受験に合格できる実力があるなら多分自分で調べられると思いますよ。

お礼

larme001さんのご指摘された通りで、あまり理論的に文章を書こうと意識していませんでした。将来医師になるものとして、より責任を持ちこれからの勉強に励んでいこうと思います。気を引き締め直されました。
また、ご回答においても参考になりました。
本当にありがとうございます！