- ベストアンサー
タンパク質実験
- みんなの回答 （1）
- 専門家の回答
質問者が選んだベストアンサー
おそらく、目的の遺伝子の酵素活性をとるためにどのようなロードマップで活性を証明できるのか？というご質問かと思います。 最もオーソドックスなやり方は、大腸菌の発現系で作製した目的タンパク質における酵素活性の証明、となると思います。 完全長のcDNAをお持ちであれば、その配列をpET(Novagen社)やpGEX(Amersham社)などの大腸菌発現ベクターに移し替えて、大腸菌に目的タンパク質を作らせます。その際に、大腸菌内に存在する様々なタンパク質の中から強制発現された目的のタンパク質のみを精製してくる必要があるので、HisタグやGSTタグの付いたタンパク質を発現させるのが一般的です。 タグによる精製（HisタグであればNiカラム、GSTタグであればGSHカラム）を行い、精製した後に基質と放射線ラベルされたP、そしてATPを加えて反応させ、基質に32Pが取り込まれるか電気泳動とラジオグラフィーで確認します。基質によっては32Pではなく、蛍光でみる方法もあります。 大腸菌の発現系でうまくタンパク質を出せないものがあれば、昆虫細胞発現系など別のシステムでタンパク質を発現させる必要があります。 長くなりましたが、流れとしては 「遺伝子を大腸菌／昆虫細胞発現系ベクターに移し替える」→「レコンビナントタンパク質を発現・精製する」→「in vitroのキナーゼ反応を行う→検出」 がよろしいかと思います。
関連するQ&A
- TLCによるリン酸化タンパク質の展開・・・
当方、TLCのを用いた実験に慣れ親しんでおらず、論文に記載されている実験のイメージがわきません。下記のような内容だと思うのですが、どなたか詳しい方がいらしたら、こういう実験方法が存在するのかどうなのかを教えていただきたいと思い、質問いたしました。脂質だけでなく、タンパクも展開されるんでしょうか・・・(化学の知識が貧困でして、お恥ずかしい質問かもしれません)。 ＜実験内容＞ あるprotein kinase(仮にA)にリン酸化活性があるかどうかを調べるため(phosphataseと共発現したときの影響を見ようとしている)、phosphataseを発現させた細胞からA抗体で内在のAを免沈した画分と、Aの基質となるタンパク質(仮にB)を32P-ATP存在下でincubateした。 これをTLCで展開したところ、コントロール細胞を用いたものでは原点から離れた位置にBのリン酸化バンド(？)が確認されなかった。一方phosphataseと共発現させたものでは、Bのシグナルが強くなった。 このphosphataseはAとassociateすることが分かっているので、おそらくAを脱リン酸化、あるいはAをリン酸化しに来る上流のkinaseを脱リン酸化することで、Aの活性を調節しているのだろう・・・ 多分こんな内容だと思います。あえてTLCを用いるメリットってあるんでしょうか？Bを基質にしたin vitro assayとかでもいいんじゃないかと思うのですが・・・。
- ベストアンサー
- 化学
- 実験初心者です。タンパク質分解について
今カイコガ体液中のタンパク質存在有無実験をウエスタンプロッティングで確認しているものですが体液を採取して２日後に実験を行ったところ目的のタンパク質があったのですが一週間後に同じロットでマイナス20度で保存したサンプルを使ったのですが最初に確認できたタンパク質が確認出来なくなってしまいました。普通フリーズしてあるサンプルは日持ちすると聞いたのですが…何が原因かわかりません。ちなみに色々な酵素の活性は阻害して有ります。
- ベストアンサー
- 生物学
- タンパク質の略号（？）を教えてくれるwebサイトをご存知ありませんか？
論文の査読者にタンパク質の名前をもっと縮小するように要求されました。例えば、「cytochrome bd protein」は、「CydR」と略すことが出来るそうです。ですのでこうしたタンパク質の略号を知りたいのですが、このあたりの話にあまり詳しくないため困っています。今回のようにタンパク質の略号を知りたいとき皆さんはどのようにしていらっしゃるのでしょうか？略号に変換してくれるようなwebサイトなどがあるのでしょうか？他、「histidine protein kinase」など複数のタンパク質を変換することが求められています。どなたかご指導宜しくお願い致します。
- ベストアンサー
- 生物学
- タンパク質の巻き戻し確認
今大学の生化学実験で変性タンパク質を巻き戻す実験を行っています。その実験に関連して、タンパク質が変性状態から巻き戻して立体構造を保持していることを解析する手法を挙げろ、という課題が出ました。 タンパク質が巻き戻っていることを確認するだけなのなら、たぶんX線結晶解析やNMRは行わないだろうし、酵素活性の測定は実験で行った方法なので（実験ではリゾチームを巻き戻して溶菌活性を見ました）、それ以外に何かないのかと探しているんですが、見つかりません。もしご存知の方がいれば教えていただきたいです。またそのようなことについて書かれている本があれば教えていただきたいです。
- 締切済み
- 生物学
- リン酸化タンパク質の細胞内機能解析について
スクリーニングしてきたリン酸化タンパク質の細胞内機能について知りたいのですが、リン酸化されるという報告のあるタンパク質の組換えタンパク質を作成または購入し、タンパク質導入試薬を用いて細胞に導入したら、この組換えタンパク質は細胞内でリン酸化されるのでしょうか？特異的なkinaseの活性があればリン酸化されると思うのですが。 また、試験管内で組換えタンパク質をリン酸化させる方法はありますか？
- 締切済み
- 生物学
- タンパク質実験について
タンパク質の基礎実験を行った際に、後日以下のような課題が出ました。 1.タンパク質の定量では1つの粗画分についての3つの異なる容量を用いて 定量を行うのはなぜか。 2.タンパク質の定量で検量線を作成するのに用いた標品タンパク質の 名称を明記する必要があるのはなぜか。 3.調整した粗画分中に目的の酵素（アルカリホスファターゼ等）が 存在するかどうかを調べる方法について考察せよ。 内容的には非常に簡単な内容だとは思うのですが、 逆に単純な問題過ぎて私の浅い知識では粗末なものしか出来あがりませんでした。 また、様々な文献もあたってみましたが参考になるようなものは見当たりませんでした。 どなたかこの問題に的確な答えがわかる方、もしくは、参考になるようなページを御存知の方、 いらっしゃいましたらどうか教えて頂けないでしょうか。 お願いします。
- 締切済み
- 生物学
- タンパク質の定量実験
学校の実験でタンパク質の定量実験を行いました。 実験材料は、モヤシ。課題レポートの考察に「モヤシが実験材料に最適な理由」という項目があります。 モヤシが安価で大量に手に入り易いという理由以外に最適な理由がわかりません。教えて下さい☆ できれば、参考文献も教えてもらえるとうれしいです
- ベストアンサー
- 生物学
- cDNAについて
あるタンパク質分解酵素を精製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動すると、60kDaのバンドが検出されました。このタンパク質にN末端と内部の部分アミノ酸配列を決定し、これに対応する合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて、cDNAライブラリーから、コロニーハイブリダイゼーション法により、全長のcDNAを単離しました。このcDNAは45kDaのタンパク質をコードしていました。 そこで、このcDNAが目的とするタンパク質分解酵素のcDNAであることは、どのような事実から示されるか。 また、このcDNAが確かに分子量60kDaのタンパク質のcDNAであるとすると、電気泳動で測定された60kDaとcDNAから予想される45kDaとの差異はどのような理由で説明されるでしょうか。 最後に、このタンパク質の生体内基質を同定するためには、どのような実験をすればよいか。 いろいろ考えたのですが、わからなかったので、よろしくお願い致します。
- 締切済み
- 生物学
