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DGGEのシーケンス解析について
卒業研究で細菌群のDenaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)を行っています。 先日、主要なバンドの切り出しを行いシーケンス解析したところ、 複数のバンドから同一の細菌株の近縁種であるという結果が得られました。 1種類の細菌から主要なバンドが2本以上検出されることはあるのでしょうか? この技術に詳しい方で理由をご存じの方、もしくはそれに関する考察の載った論文をご存じの方、教えていただければ幸いです。 ちなみに、前段階のPCRでは、プライマーセット:357f-GC、518rを使用しました。
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実験初心者でして分かりにくい質問であったなら申し訳ありません。大変初歩的な質問で恐縮です。 現在癌細胞を用いてシークエンスを行っています(ABI310)。PCRmixを作り、PCRをかけてDNAの増幅を確認して、その後PCR産物を100倍希釈してテンプレートDNAを作りプレミックス、プライマー、SDWを加えもう一度PCRをかけて、できたシークエンスPCR産物を精製しシークエンサーにかけ塩基配列を読み取る方法です。一回目のPCRではバンドは大変はっきりと見え増幅が確認できるのですが、シークエンサーで結果を見ると4色蛍光のうち、赤(T)のみほぼ真っ直ぐな波形でわずかにクネクネと山型をなしており、きれいな山型が出ません。他の3色についてはピークはそう高くはないのですが塩基配列は一応読み取れます。何度精製を念入りに行っても同じ結果で困っています。アドバイス頂ければ有難いです。
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ありがとうございました。 検討実験をしてから再度見直してみようと思います。