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リアルタイムPCRのプライマー設計について
browntrautの回答
- browntraut
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ご質問ですが、3'から何塩基というよりは、プライマー全長で何%というふうに解釈すれば良いと思います。 プライマーは適当に作っても「ワークしなかった」、なんてことはあまりないのですが、 リッチとは、GCが65%、ATが70%程度以上含まれていることでしょうか。 普通のPCRだと、3'がTで終わると、ミスが多くなるとも言われますが、リアルタイムは合成ミスがあっても全然関係ありません。バンドの濃さ（蛍光強度）を測るだけですからね。 GCリッチの対処法は、DMSOを添加することで改善できることがありますが、ATリッチは合成温度を下げるという場当たり的な対処法しか思い浮かびません。 リアルタイムPCRの目的は、普通のPCRと違って定量です。 プライマー設計で一番重要なのは、増幅範囲をあまり長くしないことです。 ハウスキーピング（GAPDH、アクチンなど）を必ずスタンダードで置くと思います。 これの増幅サイズと同様の長さになるように目的の遺伝子が増幅されるようなプライマーを設計するのが最上でしょう。
noname#250373
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