- ベストアンサー
DNAプローブの合成で
DNAプローブを作ろうと考えています。DNAプローブを作るときは、1本鎖のDNAをラベリングしなければならないらしいのですが、PCR産物(あるいは精製したもの)を加熱して一本鎖にすれば良いのでしょうか? また、参考にしている論文では、PCR産物をベクターでクローニングしたものをラベリングしているのですが、何故でしょう?
- みんなの回答 (4)
- 専門家の回答
質問者が選んだベストアンサー
その他の回答 (3)
- robita
- ベストアンサー率86% (13/15)
- shimuraushiro
- ベストアンサー率35% (20/57)
- shimuraushiro
- ベストアンサー率35% (20/57)
関連するQ&A
- DNAプローブの作り方
初めてサザン法を行い、またそれに使うDNAプローブをPCR産物から作るのですが、疑問があります。 (1)DNAを一本鎖にするために、熱変性し、キットを用いて標識するのは分かるのですが、それを氷上において一本鎖に保ちます。それを、ブロッティングしたメンブランにアプライするわけですが、いくら一本鎖にしたといえ、プローブ同士が二本鎖になることはないのでしょうか? (2)上記のようにPCR産物から作成したプローブはセンス鎖もアンチセンス鎖も混ざっているというわけですよね? (3)泳動した二本鎖DNAのゲルをアルカリ変性させ一本鎖にしますが、これをメンブランに移したということは同程度のバンドの位置に解離した二本鎖があるわけで、そこにプローブ(アンチセンス鎖もセンス鎖も含む)をアプライしたらバンドは二本観察されるのではないのでしょうか? 初心者的な質問で恐縮ですがよろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- northern blotで用いるprobeの作り方
northern blotで用いるプローブをPCR産物からつくる方法を教えてください。ある薬物をラットに投与すると肝臓内のacyl-CoA oxidase活性が上がりました。RT-PCR(リアルタイムではない)で遺伝子発現が上がっているのは明らかなのですが、定量性に欠けるということで、northern blotをしたいのですが、このときのプローブを作りたいのです。よく論文でPCR産物をプローブにしてノーザンを行っている論文を見ますが(論文では当たり前のようにプライマーの配列が書いてあり、次の文ではP32でラベルし、、、で終わっているものばかりでこの過程がわかりません)、単にPCR産物をアガロースゲルで分け、取りだし、P32あるいはDIGでラベルをするだけでよいのか、あるいは複雑な工程があるのか教えてください。いままでノーザンをしたことはあるのですがプローブはもらいものだったもので大事なことがわかりません。またこのPCR産物をプローブに用いる方法は当たり前なのか、どのくらい量がとれるか(ようは菌で増やさなくてもいいくらいの量か)、欠点、長所、よく書かれた成書があれば教えてください。
- 締切済み
- 生物学
- DNAプローブの作製法
FISHに使用するDNAプローブを作製するとき、DNAサンプルのインサートはベクターから切り離した方が良いのでしょうか?インサートは2kbpほどです。また、インサートを切り離す場合、制限酵素で切断した後どのような作業をすればよいのでしょうか?または制限酵素で切断してすぐにラベリングしても大丈夫なのでしょうか?本を見ても書いてないので困っています。
- 締切済み
- 生物学
- in situ probeの作り方
in situ 用のRNA probe作製についての質問です。 現在行っているprobe作製の手順ですが、 (1)SP6およびT7の配列を組み込んだPCR primerを使って、目的の配列とpolymeraseの配列を含んだPCR産物を得ます。 (2)このPCR産物をin vitro transcriptionのtempleteとして用い、RNAを合成します。 (3)RNA columnにより精製し、最後にgel上でバンドの確認をします。 この最後のgel上での確認の際、バンドが2本見えます。1本は目的のサイズです。スメアではないのでRNAが分解したものではないと思います。 DNAのコンタミかと考え、in vitro transcriptionの試薬を新しくし、再試行しましたが、同じ結果となりました。 どのようにしたらこの問題を解消できるのでしょうか。 in vitro transcriptionの前にgel extractionによりPCR産物は精製しているので、全く異なる配列のRNA産物ではないと思うのですが、このままin situに使えますか? もし、シグナルが得られても結果に自信が持てない気もしますが。。 よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- DNA断片をPCRで増幅し、増幅したものを電気泳動で確認するとバンドが
DNA断片をPCRで増幅し、増幅したものを電気泳動で確認するとバンドが確認できました。 そのPCR産物を使ってベクターにサブクローニングしたのですがまったくライゲーションできませんでした。 用いた方法はTAクローニングシステムです。 なぜサブクローニング出来なかったのか考えているのですが、PCR反応の際に用いたDNAポリメラーゼが3'にアデニンをうまく付加出来ないということはありえるのでしょうか? 他に原因が思い浮かびません。 どなたかアドバイスいただけないでしょうか。 よろしくお願いいたします。
- ベストアンサー
- 生物学
- PCR産物から1ugのDNAを得る方法
FISHに使うためのプローブを作製するために1ugのDNAが必要なのですが、PCR産物から1ugのDNAを得るためには普通どのような作業をするのでしょうか?
- ベストアンサー
- 生物学
- DNAのラベリングについて
DNAのラベリングについて教えてください。 図書館が工事中で使えなく、ネットでも調べてもわからなかったため質問しました。 DNAの実験を行っているのですが、PCR後にラベリングをしました。 しかし、ラベリングの意味がわからないため、何のために行ったのかさっぱりで。。。 なので、わかる方がいらっしゃいましたら教えてください。 よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- DNAの安定性について
シークエンス解析をしています。対象は、ゲノムをテンプレートとして増幅したDNA断片(PCR産物)をエタ沈したサンプルです。解析の結果を見ると、増幅時のプライマーが残っているのか、ノイズが多くてきれいに読めませんでした。エタ沈の条件を変えたりしたのですが、あまり効果はありませんでした。市販の精製キットでは少し効果があるようでした。ところが、3週間ほど冷蔵保存したPCR産物で解析したところ、以前の精製条件でも、ノイズが減ってきれいに読めるようになりました。そこで質問なのですが、冷蔵あるいは長期保存することでサンプルがきれいになって(例えばプライマーが分解して)、シークエンスがうまくいくというようなことがあるのでしょうか?
- ベストアンサー
- 生物学
- クローニングベクター
約1700bpのPCR産物をクローニングしたいのですが、サイズ的にZero Blunt TOPO PCRクローニングキットの3.5kbpのベクターでも可能でしょうか?
- ベストアンサー
- 生物学
補足
詳しい説明をありがとうございます。大変良く分かりました! 私は染色体へのin situ hybridyzationを行おうとしています。この場合はDNAプローブで問題ないのでしょうか?