検出感度について

質問

現在、EGFPを組み込んだベクターを293FT細胞に導入し、継代によるGFP発現の半減期を調べています。
実験方法として、ベクター導入の翌日から顕微鏡観察をして、毎日3視野で写真を撮り1視野中の陽性細胞数を数え割合を出します。3日目に、細胞数を数えて細胞の1/4を継代、3/4をウエスタンブロット用にサンプル化しました。そしてこの作業を顕微鏡で見られなくなるまで行いました。
そして「顕微鏡下での陽性細胞の割合の変化」と「ウエスタンブロットでのGFP発現量の変化」でそれぞれ変化を見て半減期を算出しました。当然のことながら、この二つでは半減期に違いが出ました。

しかしこの理由がよく分かりません。検出感度の違いという漠然のことしか考えられず困っています。
初歩的なことですが分かる方よろしくお願いします！

回答No.2

otx · ベストアンサー

着目するところがどこかということです。

顕微鏡は、細胞１つがどうなっているか見ることがですます。
ウエスタンは、細胞集団がどうなっているのかを見ていることになります。

極端な話、シャーレの中に１００個の細胞がいる場合に、

顕微鏡は１００個すべての細胞を見ることができます。
そのうち１個の細胞が光っていたとします。

これをウエスタンした場合、
１個の細胞では発現している、他の９９個は完全に発現していない場合は
１個の細胞は９９個の細胞で希釈されることになるので、検出できないでしょう。
（１個の細胞を９９個の細胞で割り算するようなもの）

でも、
１個の細胞で発現が顕微鏡で見ることが出来るくらいある
９９個の細胞では発現が顕微鏡で見ることが出来無いが発現はしている

この場合は、ウエスタンで検出出来るかもしれません。
この場合は足し算しているようなものです。
（１個の細胞（高発現）＋９９個の細胞（低発現）＝ウエスタンで検出可能）

お礼

もうすぐ卒論の発表で、質問されたらどうしようと思っていたので本当に助かりました！ありがとうございます！

回答No.1

otx

ちなみに、差し支えなければどちらが先に半減期が見えたのでしょうか？
私の予想では、顕微鏡の方が先に半減期がみえたのではないでしょうか？

もしそうなら、

ウエスタンの方が検出感度が高く、顕微鏡の方が低いということが前提となります。
そして、顕微鏡で見えないからと言ってGFPが全く発現していないかというと、
そうではないということです。

すると、どういうことが起こるかというと、例えば、

ものすごくまぶしく感じる人、と、光に鈍感な人
がいるとします。

ものすごくまぶしく感じる人の場合、
太陽を見たときと懐中電灯を見たとき、
どちらも目を閉じてしまいその２つの区別がつきません。
でも、豆電球を見たときは、豆電球の光を見ることができるでしょう。

しかし、光に鈍感な人の場合、
太陽はまぶしく感じると思いますが、懐中電灯は見ることが出来ると思います。
でも、豆電球は暗くて見えないのではないでしょうか。

ここで、
まぶしく感じる人がウエスタンで、光に鈍感な人が蛍光顕微鏡と置き換えてみて下さい。

蛍光顕微鏡は太陽と懐中電灯の違いはわかるが、豆電球は見えない。
ウエスタンは太陽と懐中電灯の区別はつかない、つまり
検出できる値が１００だとしたら、１００００も１００も検出して出てくる値は１００であるのです。
でも、豆電球は見ることができます。この値が５０かもしれません。

ということです。もしウエスタンの方が先に半減期が見えたとしたら、
全く意味のない書き込みになる増すがw

補足

顕微鏡の方が先でした！そういうことなんですか！！ちなみに先生にヒントとして「顕微鏡だと10^6に一個でも光ってれば検出できるけど、ウエスタンで同じ状況なら検出できないよ」という今回の解釈とは逆のことを言われましたが、これはどういうことなのでしょうか？よろしければご回答よろしくお願いします。