Hisタグをつけたタンパクの精製および濃縮について
もしわかる方がいらっしゃいましたらご教示ください。
私はII型膜蛋白(C末端にHis-Mycタグ有)を動物細胞にて発現させ、Niカラムで精製後、Amicon(MILLIPORE製)を使用して蛋白のBuffer置換および濃縮を行っています。
お聞きしたいのは以下の2点です。
１．カラム操作でWashに使用する0.01%Tween-PBSで蛋白が流れてしまうようなのですが、このようなことってあるのでしょうか？
２．AmiconでBuffer置換および濃縮を行うと、Amicon内で析出しているのか、蛋白の大部分をロスするということがおきています。考えられる原因と、析出させずにBuffer置換(Imidazole→PBS)を行い、5倍程度に濃縮させる方法がありましたらお教えください。
発現量はかなりよく、WesternBlotting・銀染色で確認済みです。
また、精製後も銀染色・Westernで確認していますので、蛋白が存在していることは確かです。濃縮(5mL→1mL)後は蛋白量が1/10くらいになっています。
以前糖鎖の多いI型膜蛋白の発現精製を行った際にも同様にAmiconの操作で大部分をロスするということがありました。そのときは糖鎖が多いせいなのか…ということになりましたが、今回の蛋白は糖鎖が3つほどしかついていなく、特別多いというわけではありません。
同様の実験を行っている人にプロトコルを確認しましたが、やっている手技に間違いはないように思います。
同様の経験をお持ちの方、また知識のある方、いらっしゃいましたらよろしくお願いいたします。
