- ベストアンサー
PCRのサイズマーカーとは?
ご存知の方、よろしくお願いいたします。できるだけ詳しく知りたいと思っていますので、良いサイトなどがありましたら、ご紹介ください。 アガロースゲルを用いたPCRです。 今のところの疑問点です。 マーカーというのは、目的遺伝子が含まれている箇所を増幅した時、それがうまくいったかどうか確認するための物差だ、ということでいいでしょうか。 しかし、たとえば、マーカーが1000bpの場合、そのマーカーの箇所がいくつも線が入っていて、どれが目的の塩基対の長さになるのか、どうしたらわかるのでしょうか? よろしくお願いします!
- 生物学
- 回答数2
- ありがとう数2
- みんなの回答 (2)
- 専門家の回答
質問者が選んだベストアンサー
>それとも、実験によっては、1000bpだけ入ったマーカーもあるのでしょうか? 1000bpだけ入ったマーカーは聞いたことはありませんね、だって1000bpのものしか測れませんから >たとえば1000bpならば、ウエルから一番遠いところが100だとして、そこから10番目の位置が、1000bpだと考えるのでしょうか? そうですね、ただ、100bpが流れきっていないことが前提です。ゲル濃度や使う色素(BPB,XCなど)によって目安は違いますが、まずはマーカーを流しきらないことが重要です。 ただ、流しきったとしても上から数えればいいことですし、基本的に分子量マーカーは一定数(200bpごとなら1000bpと2000bpとか)濃くなっているので、それを見れば大体わかることかと
その他の回答 (1)
- owata-www
- ベストアンサー率33% (645/1954)
とりあえず過去質問より http://okwave.jp/qa1420756.html?ans_count_asc=1 >マーカーというのは、目的遺伝子が含まれている箇所を増幅した時、それがうまくいったかどうか確認するための物差だ、ということでいいでしょうか。 いいです >マーカーが1000bpの場合、そのマーカーの箇所がいくつも線が入っていて、どれが目的の塩基対の長さになるのか、どうしたらわかるのでしょうか? これの意味がわかりません、マーカーの1000bpにあるのは1バンドのみになるはずです どのような状況なのかもう少し詳しく補足にお願いします。
補足
すみません、表現が悪く、誤解を与えてしまいました。 実験で使われていたマーカーは、100bp、200bp…と、100ずつのものがいっぱい入っていたように記憶しています。マーカーのところが、規則的に何本も線が入っていました。 こういう場合、たとえば1000bpならば、ウエルから一番遠いところが100だとして、そこから10番目の位置が、1000bpだと考えるのでしょうか? それとも、実験によっては、1000bpだけ入ったマーカーもあるのでしょうか? お願いいたします!
関連するQ&A
- RT-PCR
RT-PCRでcDNAの作成を行っています 通常は、 RNA抽出物を逆転写して (polyA primerで) PCRへもっていっています。 しかし 先日ふと思い立って、 RNA抽出物を鋳型として そのままPCRしてみました。 すると、このRNA抽出物を鋳型としてPCRした場合も、 cDNAを鋳型とした時と同じ位置にバンドが出てきました。 このバンドは、鋳型RNAをRNAse Aで処理すると消えます。 このPCR産物の シークエンスをチェックしてみると、 目的遺伝子であることが確認できました。 (全長800bpの中の500bpのシークエンスを確認) RNA抽出キットはキアゲン社のものを使っています。 精製度が高いということなのでDNase処理は行っていません。 この場合、 RNAを鋳型として 目的遺伝子が増幅しているのでしょうか? あるいは、 ゲノムDNAがコンタミが原因で イントロンを含んだものが増えているのでしょうか? 通常、 DNA polはRNAを鋳型として 遺伝子増幅できないといわれていますが、 本当でしょうか? 何か参考になる文献があれば 教えていただけないでしょうか? よろしくお願いいたします。
- 締切済み
- 生物学
- PCR
2本のプライマーで目的遺伝子をPCRしました. その後,得られたPCR産物のsequenceを確認したら,2本のプライマー間のsequenceには変異や塩基の欠落等はなかったのですが,それぞれのプライマーの部分に塩基の欠落がかなり見られました. プライマー間に変異があったとしたなら,間違って塩基を取り込んでしまったのだろうと考えられるのですが,プライマーの部分は購入したまんまの状態なので,業者のプライマー合成ミスということなのでしょうか? 当然プライマーの部分のsequenceがあっているものもありましたので,恐らく購入したプライマーは目的の1種類の配列だけではなくて,間違った配列のものも含まれていると考えられるのでしょうか? または違った理由で,この様なことが起こるのでしょうか?
- ベストアンサー
- 生物学
- PCR産物のゲル抽出・制限酵素処理後の電気泳動
大腸菌のゲノムからPCRで目的遺伝子を増幅し、アガロースゲル電気泳動にて目的位置にバンドが出ていることを確認した後、目的バンドを切り出してゲル抽出をしました。 その後、2種類の制限酵素で1晩処理し、アガロースゲル電気泳動にて泳動しましたところ、目的位置よりも高い(重い)位置にバンドが出ました。((1))PCR後にはなかったバンドで、PCR産物の泳動後のバンドより高い位置にあったため、酵素処理の切れ残り・切断のされすぎなどは考えられないかと思っています。 仕方がないので、非目的バンドを避け、目的のバンドを切り出してゲル抽出・エタノール沈殿を行った後、アガロースゲル電気泳動にて泳動したところ、やはり非目的バンドが(1)と同じ位置に出ました。 また、別の遺伝子を別プライマーを用いて、同じような作業でPCR・ゲル抽出・制限酵素処理(上記とは別の2種類)を行ったところ、やはり同じように高い位置にバンドが出てきてしまいます。 PCRに使用する鋳型のゲノムは同じ物を用いているので、ゲノムがおかしいのでしょうか? そうだとしたら、PCR後に変なバンドが出ると思うのですが、PCR後には目的のバンドしか見えません。 このような場合、どのような作業が必要でしょうか? 同じような経験がある方、是非教えてください。 追記:非目的バンドは、ちょうど目的バンド×2くらいの重さの位置に出てきています。 なんらかの形で2つがセルフライゲーションしてしまうことなどはあるのでしょうか?
- 締切済み
- 生物学
- pcr,アガロースゲル電気泳動について
学校でPCRからアガロースゲル電気泳動の実験をしたのですが、考察で分からないことがありこまっています。 どなたか答えていただけませんか? 1.電気泳動を行い正しくアニーリングできたかを確認するためにはどうすればいいですか? 2.PCRでDNAのすべての塩基配列がわかっていればPCRプライマーが目的位置に正しくアニーリングする確率も、間違った位置にアニーリングする確率も正しい位置にアニーリングする確率が間違った位置にアニーリングの何倍になるのかがわかると思うのですが、具体的になにをすればその確率がだせるのか? 以上の2点なのですができたら早めに回答をいただけると嬉しいです。 よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- 定量PCRのスタンダード作製
最近、リアルタイムPCRで増幅産物の定量を行うようになったのですが、 市販されているプライマーとスタンダードのセットでしか測定をしたことがありません。 自身でデザインしたプライマーで増幅した産物の定量を行いたい場合、 スタンダードはどのように作製したら良いのでしょうか? PCRの増幅産物をプラスミドにクローニングしてスタンダードを作製するようなことを読んだのですが、悲しいことに理解できずにおります。 また、塩基配列が判明している変異遺伝子やウイルス検出にあたり、手元に陽性コントロールとなるサンプルがないとスタンダードを作ることは無理でしょうか? 具体的な解説、初心者向けのおすすめ書籍・webサイト等がありましたら、教えてもらえないでしょうか。
- ベストアンサー
- 生物学
- PCR法について
http://www.nurs.or.jp/~academy/igaku/a/a1123.htm 検索した所上記のHPがみつかりました、そこで疑問なのですが、標的の塩基配列は未知でよいとはどういうことでしょうか?授業では「増幅予定の塩基配列は既知でなくてはならない」と聞きました。それとプライマーが標的の塩基配列と完全と対合してなくてもよいとはどういた事でしょう?合わさって無くてもよいとは一体? これは授業での事なのですが、100kbを超える断片に対してPCRは実効不能であると聞きました。多すぎるとまた問題がおこるのでしょうか? すみませんが、どなたかご解答を…TT
- ベストアンサー
- 生物学
- PCRにおける偽陰性の確認
PCRにおける偽陰性の確認 マウスの臓器からDNAを抽出し、病原体検査の確立を検討しています。 その際に、偽陰性を確認するため内部標準物質であるactinのprimerを添加しPCRをしバンドが出れば、正常にPCRが行われているという判断ができます。しかし、ゲノムDNAの位置にはほとんど見えない薄いバンドしか認められず、偽遺伝子として違う箇所にかなり濃いバンドが認められました。偽遺伝子でバンドが認められたことで、正常に遺伝子が増幅されたといこうとの判断になりますでしょうか?教えてください。
- ベストアンサー
- 生物学
お礼
どうも有り難うございます。 URLも拝見しました。勉強になりました。 今後の実験で、もっと注意して、マーカーの部分を見てみようと思いました!