プラスミドプロファイル

質問

E.coliを関崎の変法にてプラスミド抽出を行い、その後0.7％ゲルにて電気泳動を行いました。マーカーにはタカラのλ-HindIIIを用いています（環状のプラスミドを流した場合のマーカーがわからなかったもので・・・）。
その結果５本のバンドが出ました。
その内訳は、λ-HindIIIの最大の23130bp以上のところに2本、23130bp付近に1本、2027bp以下に2本です。
ただ、23130bp付近に1本はすべての株から見られているので染色体由来なのかなと思いました。
そこで、質問なのですが、染色体由来なのか、プラスミドなのかの区別を教えてください。よろしくお願いします。

回答No.3

tatoo

どんなプラスミドの抽出方法であれ、やる人によってはいろんな事が起こり得ます。一概にこの方法ではこのサイズのDNAが抽出されないはずだとかいう考えは危険だと思います。やる人の経験値によってはゲノムDNAやRNAがコンタミしてるなんてザラにあります。
また、使ったDNAマーカーはおっしゃる通り環状ではないので、それと環状のプラスミドDNAを比較しても分子量の参考にはあまりならないと思われます。
さて、どのバンドが染色体由来DNAかその他RNAなのか、またはプラスミドDNAなのかを見分ける方法としては、一般的には制限酵素処理によるmapの確認だと思います。
大腸菌に導入されているプラスミドDNAがどのベクターであるか、くらいの情報は持って実験をするのが普通なので、そのベクターの制限酵素mapから「この制限酵素で切ればこうなる」という事をシミュレーションしておいて、複数の制限酵素で切って確認するという作業を行うのが普通だと思われます。簡単に言うと、思い通りに切断できるバンドがプラスミドDNAだということです。このとき、ベクターにインサートがあったりした場合は、それなりに複雑になりますが、行う作業は変わりません。分子生物学の基礎ですのでがんばってください。
しかし、使っているプラスミドDNAが何かわからず、インサートもわからず、それでも見分けたいというのは不可能に近く、そのくらいの情報も得ないで実験するのは無駄というものです。まずは知っている人に聞くことから始めるべきかと思われます。

回答No.2

1fan9

Molecular Cloningに載っているような、一般的なアルカリSDS
法のプロトコールに即して、プラスミド抽出を行った場合、
操作がうまく行えていれば、ゲノム(染色体)が取れてくること
はないと思います。
大腸菌は、大きな環状DNAと大型のプラスミドを持っていること
がありますが、それらは抽出の操作中に沈殿し、最終産物には
残りません。
(関崎の変法というのはちょっと存じてません。すみません。)

プラスミドに抗生物質耐性遺伝子が乗っていることが分かってい
るのでしたらその領域を調べてプライマーを設計し、PCRなどで
増幅し、確認することが可能だと思います。

また、プラスミドの場合、直鎖状(あるいは開環状)、スーパーコ
イルの特徴的なバンドが出るので、だいたい分かるはずなのです
が…

電気泳動だけの情報では、だいたい、バンドのサイズと形状から
ゲノムかプラスミドか判定するのが一般的かもしれません。
正確な情報ではないですが。
確かに分けの分からないバンドがでることもあり、なかなか調べよ
うがないということもあります。

回答No.1

1fan9

学生さんでしょうか？もしそうでしたら先輩や先生に聞かれるのが速いと思うのですが…

そもそもプラスミドのサイズが分かっていないのですか？
分かっていたら、そのプラスミドサイズに該当する箇所周辺に出るはずです。

23130bp以上のプラスミドは普通抽出しないので、3本はゲノムDNAの断片だと思われます。残りの二本がプラスミドです。

2027以下のは直鎖状(あるいは開環状)、スーパーコイルのプラスミドだと思うのですが…

補足

ありがとうございます。
私は学生です。
プラスミドを保有しているかどうかを知りたくおこなったため、数およびサイズは不明のものです。
プラスミドかゲノム由来かはプラスミド抽出では確定できないものなのでしょうか？