ノザンブロティングについて

質問

初歩的なことかもしれませんが、質問させていただきます。
初めてノザンを行っています。メンブレンに転写する前にエチブロによる染色を行ったのですが、何も写りませんでした。
ゲルはノザン時のゲルで、染色はノザンのプロトコル中にあった方法を用いて行い、染色時用のマーカーはλHindIIIを約200ng用いました。
なぜマーカーが写らないのがわかりません。2回行ったのですがマーカーがさっぱりです。
お願いします。

回答No.1

Mr_Spock · ベストアンサー

RNAは一本鎖なのでもともとEtBrに染まりにくい上に、フォルムアルデヒドのような変性剤の存在下ではほとんど染まりません。二本鎖DNAもRNA電気泳動の変性条件では一本鎖に解離しているので同様です。もし後染めするなら、あらかじめゲルを念入りに水洗いして変性剤を抜く必要があります。それでも感度は、通常二本鎖を染めるのより1 オーダー以上低いと思います。

電気泳動したRNAをEtBr染色する方法の最近のトレンドは、泳動サンプル調製用の変性バッファーにEtBrを少量入れておいた上で（例えば一サンプル当たり0.5 ugとか、50 ug/mL以下の濃度なら、移動度やブロット効率に影響はないとされています。）、通常の加熱変性を行う方法です。インターカレーションによる通常のカップリングではない方法でEtBrが核酸と結合するようで、泳動中にEtBrが抜けることはなりませんし、染色強度も二本鎖にひけをとりません。

どうせNorthern blotをするんなら、ブロットした後にメンブレンをメチレンブルーで染めるという方法も一般的です。酢酸ナトリウム溶液（0.5 M, pH 5.2程度）にメチレンブルー（0.1%程度）を溶かした液の中で、しばらく染色し、蒸留水でリンスしてバックグラウンドを抜くだけです。EtBr染色まではいかなくても、かなり感度は高いです。マーカーレーンだけ切り離して染めてもいいですし、メンブレン全体を染めてサンプルRNA像やトランスファーの様子を確認してから、ハイブリに持っていく可能です。

以上、どちらの方法もちゃんとした実験手引き書には載っていると思います。

最後に、RNA電気泳動のときにDNAマーカーを使うのは、市販の一本鎖RNAマーカーが手に入りやすくなった最近は流行りません。一本鎖に変性するとはいえ、DNAの移動度はRNAと微妙に違うそうですし、非変性条件で泳動してみると分解していないように見える二本鎖DNAも、実はニックだらけのために一本鎖に変性するとバラバラになったりする可能性があります。バラバラになれば正確なサイズが出ないばかりでなく、全体がスメアになってバンドが見えないことがあっても不思議ではないです。それにlambda DNAの制限酵素消化物では、各バンドの強度がそろってないので、高分子のバンドは見えても低分子が見えないということも起こりがちです。

お礼

具体的にありがとうございました。

回答No.2

Dr_Hyper

お金を使えばいいというものではありませんが、
SYBR® Green II RNAゲル染色を行えばいいかな。
変性条件なのでEtBrではあらってもそう簡単には染まらないと思います。ノザンの確認の為に行っているのに手間がかかっても仕方がないので、感度のいい蛍光試薬に頼る方が現実的かな。

参考URL：

http://www.invitrogen.co.jp/catalogue/molecular_probes/genomics/content11/index.html

お礼

長い間、私の所でノザンをやっていなかったらしく多々足りないものがあり、とりあえずできる程度のもので行っています。
これからも行うのであれば、そちらも考えて見ます。