サンガー法について

質問

塩基配列解析のサンガー法がよく理解できません。
primer、ddNTP、dNTP、templateが必要ということですが、templateに対して、dNTPが水素結合で相補的に結合するわけですよね？
そのとき、ddNTPを加えておくと、ddNTPがランダムに結合するというのはどういうことですか？そのきっかけはなんですか？
例えば、dATPには、ddATPがもともとホスホジエステル結合してるってことですか？
なぜ、『ランダムに』ddNTPがどのように結合するのかその意味が分からないのです。

回答No.2

geneticist12 · ベストアンサー

＞なぜ、ddNTPが必ず取り込まれるのじゃいけないんですか？

全部のtempleteで同じ塩基で必ずddNTPが取り込まれると、そのバンドしか出ません。あるものはその塩基はddNTPで伸長がとまり、別のものはそこはdNTPでもっと先の塩基でddNTPで伸長がとまる、というのではなくては一塩基ごとのバンドはでません。100塩基目で出たバンドは、99塩基目まではdNTPが取り込まれ100塩基目でたまたまddNTPが取り込まれたのです。100塩基目でddNTPを取り込んでしまった鎖はそれ以上伸長しません。

実際、基質として混合するdNTPとddNTPの比率は大事で、ddNTPが少なすぎれば、プライマーから近い塩基のバンドは出にくくなり、多すぎれば遠いほうまで伸長する確率がさがり、長い配列が読めなくなります。

お礼

修正です。

>ということは、反応液の中で、templateに相補的なDNA鎖が『何本も』作られていて、例えば5'-ACGTAGTCC-3'という配列だった場合、『ddATP』が反応液に入っている場合のときは、『templateの3'から読んで、生成される相補鎖DNAは5'から』三番目のAで伸長が止まっているDNA鎖も有れば、６番目のAで伸長が止まっているDNA鎖も有るということでしょうか？

補足

なんとなく分かってきました。
ということは、反応液の中で、templateに相補的なDNA鎖が作られていて、例えば5'-ACGTAGTCC-3'という配列だった場合、ddTTPが反応液に入っている場合のときは、三番目のTで伸長が止まっているDNA鎖も有れば、６番目のTで伸長が止まっているDNA鎖も有るということでしょうか？それらが均等に生成される様に、ddNTPの濃度に気をつけるということですよね？どうしてそんなにうまく、配列の全体まで行き渡るのでしょうか？あるバンドは薄くなったり、濃くなったりしないのですか？

回答No.3

geneticist12

You got it. あなたの理解の通りです。

＞どうしてそんなにうまく、配列の全体まで行き渡るのでしょうか？あるバンドは薄くなったり、濃くなったりしないのですか？

現在では、メーカの作っているキットでSequenceをやるのが普通で、メーカーが改良・最適化してくれていて、ユーザは細かいことをほとんど考えなくてもほとんどの場合うまくいくようになっています。ふたむかし前なら、読みたいところを読むために、市販のキットでも自分で微調整したものですが。

お礼

ありがとうございます。大体、解決しました。

回答No.1

geneticist12

templateにたいしてDNAが合成されるときに、dNTPもddNTPも同じように基質として使われます。dNTPとddNTPを混ぜて合成反応をすると、一塩基伸長するときにdNTPが取り込まれるかddNTPが取り込まれるかがランダムだということです。

template DNA分子によってそれぞれ、○○番目のAのところでdATPを取り込むかddATPを取り込むかがランダムである、dATPを取り込んだものはさらに反応が進むけれど、ddATPが取り込まれたものはそこで反応が止まるということです。

これで、わかりますか？

補足

ありがとうございます。
ですが、その意味が分からないのです。
なぜ、ddNTPが必ず取り込まれるのじゃいけないんですか？
配列に応じて塩基が相補的に結合するわけだから、確実に取り込まれるのでないと、正確なバンドは出てこないのではないでしょうか？
dNTPが取り込まれたものに関しては反応が進むということは、そのバンドは正しい長さで検出されないってことじゃないですか？
その辺が理解できません。