TRIzolでの96ウェルプレートからのtotal RNA の抽出

質問

96ウェルプレートでの動物細胞培養後、そこからTRIzolを使ってのtotal RNA の抽出、およびReal-Time PCRが出来ないかを考えております。少量の細胞からRNAを抽出するための色々なKitがあるのは知っているのですが、高いので現在ラボにあるTRIzolを出来れば使いたいと考えております。

あるsiRNAをトランスフェクション後、24時間、48時間のインキュベーションした細胞を使う予定です。8000細胞からスタートさせるプロトコールを使う予定です。
TRIzolのプロトコールに「10cm2に対してTRIzol 1ml」とあったのですが、これを96ウェルプレートの1ウェルに当てはめると約30マイクロリットルということになります。

細胞の増殖具合や目的遺伝子の発現状況によって結果は変わるかとは思いますが、このような少量のTRIzolでRNA抽出、そしてReal-Time PCRは可能なのでしょうか‥？　逆に、TRIzolでどのくらい少量の細胞からRNAを抽出可能なのでしょうか？

初歩的な質問ですいません。
ご存知の方、経験のある方、アドバイスを宜しくお願い致します。

回答No.1

walkinoctopus · ベストアンサー

私は24well dishまででしたらsiRNA処理→RNA抽出をやったことがあります。96wellでもRNAを抽出して発現量の解析は十分可能だと思いますが、TRIzolのvolumeはハンドリングの問題もあるので30?lよりは多くした方がいいかなとは思いますが。
ただ、それよりも気になることは、発現量の解析はノックダウンの確認程度の意味なのでしょうか？また、細胞の種類は何なのか差し支えなければ教えていただけないでしょうか？ノックダウンの確認程度なら問題ないですが、細胞種によってはある程度厳密な発現を比較したい場合96wellでラフな結果を取った後にさらに大きなdishでの検討が必要になるかもしれません。また、Real time RT-PCRの際にインターナルコントロールを何にするか、あるいは細胞数で揃えるかというのも一応考慮する必要があるかもしれません。

お礼

回答ありがとうございました。
発現の解析はまさにノックダウンの確認の意味です。細胞数的に十分量のRNAが採取できるか心配をしておりました。TRIzolで試してみたいと思います。
ちなみに細胞は大腸癌のHCT116を使用する予定です。インターナルコントロールはGAPDHを使う予定です。細胞数で揃える方法もあるのですね。勉強になりました。