DNAのコンタミ

質問

RT-PCRをするため、植物細胞からRNA抽出を行っているのですが、DNAがコンタミしてしまいます。解決策はあるのでしょうか？RNA抽出は、キアゲンのキット使用の後、ISOGEN処理、DNaseI処理です。ご回答のほどよろしくお願いします。

回答No.3

geneticist12

短い方（目的のcDNA由来）は増えるけれど、長い方（ゲノム由来）が増えない、増えにくい条件設定が必要です。

400 bpと850 bpだと、どちらも十分に短いのでcDNA由来だけを増やすのは難しいと思います。

回答No.2

geneticist12

QiagenのRNeasyは、もっともDNAのコンタミがなく、信頼性の高いキットの一つだと思います。これのあとISOGEN処理（グアニジンチオシアネート・酸性フェノール抽出法だと思いますが）をするのはあまり意味がないように思います。
順番が逆なら頷けますが。

マニュアルに忠実に従ってやれば（たとえばオーバーロードしないとか）、ふつうはRNeasyだけで十分ですが、ごく微量のDNAのコンタミが問題になるときは、同じ会社からRNeasy用に出しているDNaseを試してみてください。

またAmbionのキットも評判がいいです。もしQiagenに不満を感じるなら試して見るのもいいでしょう。

とはいえ、完璧にDNAのコンタミをzeroにできるキットもDNaseもないと思ってください。程度の問題です。
どうしても、DNAからPCRが増えてくるようなら、大きめのイントロンを挟んだプライマーを設計するに限ります。

お礼

ご回答ありがとうございました。
一応、RT-PCRのコントロールとしてEF1αのイントロン
450bp+エキソン400bpを挟んだプライマーを設計しているのですが、泳動してみると850bpと400bpのバンドがでてしまいます。もう少し長めのイントロンを挟んだ方が良いのでしょうか？

回答No.1

MIYD

キアゲンの何のキットを使ったのでしょうか。

最初に試すのは
ISOGENで中間層をとらないように気をつける
酸性フェノール抽出をしてDNAを除く
DNaseIを多めに入れる
DNaseI処理を長くする

それで駄目なら
増幅される配列をイントロンを挟んで、DNA由来のバンドが増えないようにする
RNA精製カラムを使う

お礼

ご回答ありがとうございました。DNase処理をもう一度見直してみます。