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PCRの結果についての質問
negigiの回答
Stepdownが必要なターゲットに出会ったことが無いので、なんともいえないです。 Tmを上げたということは、新しいプライマーを設計したということでいいんですよね。それでもうまくいかないとなると、ターゲットか試薬に問題があるようにも思います。 また、#2の方も聞いてますが、プライマーに制限酵素配列とか入れてたりしますか？当然ですが、相同出ない配列が入っている場合は、アニール温度は理論値よりも下がりますよ あと、再度聞きますが、ポリメラーゼのトラブルシューティングについては確かめましたか？ ターゲットの純度や、GC含有率については問題ないですか？
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PCRのことについて質問なのですが、現在私が行っている細胞から、DNAを抽出しPCRを行うという実験で、うまくいかず行き詰っているので質問させていただきます。 現在以下の条件でPCRを行っているのですが、うまくいきません。 組成 forwardプライマー：1μL（=1pmol/μL） reverseプライマー：1μL（=1pmol/μL） Go Taq 5xBuffer：10μL dNTP：5μL(final濃度で200μM) Go Taq DNA polymerase：1μL 鋳型DNA：1μL MgCl2：3μL 滅菌水：28μL 計50μL 反応 ・反応 96℃：5分 ↓ 25サイクル 96℃：1分 55℃：1分 72℃：1分 ↓ 72℃：5分 ↓ 4℃： 設計ではPCR産物の長さは約100塩基ですが、これを行うと50塩基のPCR産物が検出され、100塩基のものはまったく確認することができませんでした。 また、プライマーの長さは約20塩基です。プライマーのTm設定はアニーリング温度を55℃と設定して、それよりも+5℃のTm値を持つよう設計しました。 同様の質問をyahoo知恵袋でも行いまして、回答してくださった皆様の条件でも行いましたが、いずれも同じ結果となってしまいました。 http://detail.chiebukuro.yahoo.co.jp/qa/question_detail/q1449649784 また、最近sigma社のXNATR REDExtract-N-AmpTM Tissue PCR Kitの組成液にプライマーと細胞抽出液を入れてPCRを行いましたが同じ結果でした。 原因、改良点の指摘がありましたら是非教えていだけますでしょうか？
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