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PCRの結果についての質問
negigiの回答
- negigi
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前回の質問に答えたときは、プライマーを変えればマシになるかと思ってたんですが、ここまでとは・・・。 とりあえず、 酵素の説明書にあるTrouble Shootingに、非特異のバンドが多い場合について書いてあると思うのですが、すべて試しましたか? 目的配列のGC含有率はどれくらいでしょうか。あまりにGC richであれば、いろいろ検討する必要があります。 テンプレートDNAはきれいですか?テンプレートの純度が気になります。きちんときれいに抽出できていますか? プライマーが2組ということは、ForwardとReverseが2種類ずつあるんですよね。組合わせは4通りですが、全部試さないのですか? あと、もっとTm値を上げたほうがいいですよ。自分はシングルバンドを出したいときは、アニール温度が60~62℃になるようにプライマーを設計しています。 うまくいかないなら、前回の回答で出てきたnested PCRや、stepdown PCRという方法もあります。調べてみてください。 最終手段として、「目的の産物もできている」と考えて、100bpあたりをゲル切りして抽出し、それをテンプレートにPCRする方法もあります。あくまで、どうしてもうまくいかないときの最終手段として。 とりあえず、こんなとこでしょうか。
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補足
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