- 締切済み
blue-native PAGE
blue-native PAGE blue-native PAGEに関して質問です。 現在、blue-native PAGEを用いてあるタンパク質を泳動しているのですが、 バンドがシャープにならずに、縦に広がったり、波打つような形になってしまい、 非常にいぴつなバンド？になってしまいます。 バンドをシャープにするためにはどうすればいいでしょうか？ 以下に、バッファー組成等を書いておきます。 サンプルバッファー、泳動バッファーはインビトロジェンのサイトにあるのを使ってます。 http://www.invitrogen.jp/electro/BN-PAGE.pdf#search='bluenative%20PAGE' サンプルバッファーには1×のときの濃度が5%になるようにグリセロールを使用しています。 ゲル組成はnature protocols 2006 Blue native PAGE に記載されているのを使用しています。 ただし、グラジエントではなく、濃縮ゲル4%, 分離ゲル13%を使用しています。 泳動が3分の1程進んだら、cathode bufferのCBB濃度を0.002%にしたbufferに交換しています。 サンプル調整は、サンプルバッファーを加えて95℃,3分ボイルしています。
- eiloc
- お礼率70% (21/30)
- 生物学
- 回答数1
- ありがとう数1
- みんなの回答 （1）
- 専門家の回答
みんなの回答
- ryumu
- ベストアンサー率44% (65/145)
回答ではないのですが、参考URLを。 それと、サンプルのボイルはマズイですよね？ Native状態でなくなってしまいますし。。。
関連するQ&A
- native-PAGE
実験でnative-PAGEを始めたのですが，バンドがきれいに出ません（スメア）．SDS-PAGEではきれいにバンドが出ています． 目的蛋白質はオリゴマーで等電点は7.2です．還元剤は入れずに泳動しています． ゲルはSDS-PAGEで通常用いられている組成からSDSだけを除いています．具体的には， 15％アクリルアミドゲルで 濃縮ゲルはトリス-塩酸（pH 6.8，SDS-） 分離ゲルはトリス-塩酸（pH 8.8，SDS-） 泳動用緩衝液はトリス-グリシンです． 電流は18mAです． native-PAGEは蛋白質の電荷で動くので，ゲルのpHとかに依存するのかなとも思うのですが，よく分かりません． 何か参考になるURLやアドバイス等ありましたら，教えていただけると幸いです．宜しくお願いします．
- 締切済み
- 生物学
- native PAGEの泳動バッファーについて
古い文献でnative PAGEの方法を調べていたらバルビタールバッファーを使って泳動している方法にあたったのですがこのバッファーはどういう場合に使うのでしょうか？ そもそも売っていないようなのですが・・・ 売っているメーカー、使用目的をご存じの方教えて下さい。
- 締切済み
- 生物学
- SDS-PAGEゲルのトラブル
あるタンパク質を生体物質から私の研究室（かなり小規模な研究室なので聞ける人があまりいないのです。）では精製していて、随分以前からそのタンパク質が精製できているかどうかをSDS-PAGEゲル上で確認していました。 ところが、ここ1ヶ月ほど前からそのSDSーPAGEゲルの電気泳動結果がおかしいのです。。 例えば、 *本来あるはずの低分子タンパク質のバンドが薄くしか（もしくは全く）見えない。高分子領域にスメアがたくさん見える。 *本来サンプルがアプライされているはずのないレーンにスメアっぽいバンドがたくさん見える。（特に高分子領域に） *バンドはかなりスメアっぽく見える。（シャープなバンドではない。） あと気づいたことですが、泳動直後のゲルはかなり暖かくなっていました。 このような原因として何が考えられるでしょうか？本当に困っています。 ちなみに、私たちの研究室では、 *SDS-PAGEゲルは自作 ポリアクリルアミド、SDS等を水溶液にしたものが冷蔵庫にストックされていて（2.3ヶ月前に作られました）、その水溶液と常時調製している10％APS溶液そしてTEMDを混ぜ合わせて常に作っています。 *ローディングバッファー 半年ちょっと前に作られて冷蔵庫にストックされたものを使っています。 *泳動用バッファー 10倍のTrisベースのバッファーが常温でストックされているので、それを随時希釈して使っています。 *泳動条件 150V（電気泳動ユニットに異常は見られません。）
- 締切済み
- 生物学
- 2D PAGE
初心者です。あるリコンビナントタンパク（2mg/μl)をバイオラッド社の機器で等電点電気泳動しました。一次元目は、ph7付近に出ました。そこから続けて2次元目のＳＤＳ－ＰＡＧＥをしましたが、20Ｋｄａあたりになるはずが、結果は50-70Kdaのところに、バンドが濃く出ました。原因はわかりませんが、類推されることがあれば、お教えください。 試薬 膨潤バッファ： 7M Urea 420mg/ml 2M チオUrea 152mg/ml 4% CHAPS 40mg/ml（界面活性剤） 1M DTT 20μl/ml 0.1% BPBブロモフェノールブルー 20μl/ml ＳＤＳ平衡化バッファ： 1.5M Tris Hcl buffer pH 8.8 6.7ml Urea 72.07g グリセロール 69ml ＳＤＳ 4.0g BPB(0.1%) 4ml 10×泳動バッファ 1L 4℃で保存 Tris 30.3g グリシン 144.0g SDS 10.0g 泳動 サンプルが固形のときは、膨潤バッファで溶かす 液体のときは、 膨潤バッファ：サンプル＝９：１（もしくは ４： 還元・アルキル化 還元用 ＳＤＳ平衡化バッファ ＋ＤＴＴ（冷） 50mg/5ml （よく溶かすこと） アルキル化用 ＳＤＳ平衡化バッファ ＋ヨードアセトアミド（冷） 125mg/5ml トレイに還元用を3ml入れ、ストリップゲルを入れ（ゲルが上側）、30min shaker ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 分離ゲル： MilliQ 3.4ml(15%なら2.4ml) 30mlアクリルアミドビス（毒） 4.0ml(15%なら5ml) ゲルバッファー（1.5M Tris Hcl buffer pH8.8） 2.5ml 10% ＳＤＳ （過硫酸アンモニウム） 0.1ml 10% ＡＰＳ 50μｌ ＴＥＭＥＤ 5μｌ
- 締切済み
- 生物学
- Native-PAGE SDS-PAGE 分子マーカー 電気泳動
Native-PAGEに用いる分子マーカーを探しています。 Native-PAGEを行ったときに、SDS-PAGEに用いる分子マーカーを使用したところ泳動速度が違ったせいかsampleの進み方が遅かったようです。 私の目的分子量の大きさは25-50kDaあたりなのです。 Native-PAGEでこの大きさのタンパクを見る場合、適した分子マーカーがありましたら、教えていただけないでしょうか？ よろしくお願いします
- ベストアンサー
- 生物学
- SDS-PAGEでのミス
初学者です。 ゲル板をセットした状態で ゲル穴にマーカー、サンプルをアプライしました。 それから泳動バッファを注いだのですが 電気泳動したあと染色してみると 明らかに隣のゲルにマーカーが入ってるバンドでした。 せっかくのサンプルは全く見えません。 ３件となりまで影響がありました。 また、アプライは1０μl加えましたが そのとき、すっと液がしたへ行った手ごたえが少なかったです。 また、100ngのタンパク量がサンプル中に入るように計算して 銀染色を行いましたが、きっちり見えたのは６つのうち１つだけ でした。 これは希釈がへたということなのでしょうか？？ 具体的に皆様などうされているかお教えください。
- ベストアンサー
- 生物学
- SDS-PAGEで分離したタンパク質のバンドの太さは、どのような条件に依存するのですか？
SDS-PAGEでタンパク質を分離したとき、同じタンパク質でもバンドの太さ(泳動方向)が太かったり、細かったりしてしまいます。これは、どの泳動条件によって変化しているのでしょうか？私は次のような原因を考えましたが、正しいかは分かりません。 ゲルの濃度に依存していると考えた場合、アクリルアミドの濃度を高くすると、バンドは細くなると考えてよいのでしょうか？また、濃縮ゲルの高さに依存していると考えた場合、濃縮ゲルを長くすると、タンパク質はより濃縮されバンドは細くなるのでしょうか？ ご存知の方、回答を是非お願いいたします。
- ベストアンサー
- 生物学
- SDS-PAGEの試薬調製について教えてください
学生実験の準備で困っています。前任者からの引継ぎが曖昧で、担当の先生も常勤ではないために詳しいことが分かりません。 サンプルバッファーとして、 ナカライテスクの30567-12 Sample Buffer Solution without 2-ME(2x) for SDS-PAGE pH6.8 0.45um フィルター濾過済 組成：0.125M-Tris-HCl, 4(w/v)%-SDS, 20(v/v)%- グリセリン,0.01(w/v)%-BPB を使用したいと思います。 (1)これは、小分けにして-20℃（-80℃？）で保存することが可能でしょうか。可能な場合、一般的にどのくらいの期間もちますか？ (2)加える還元剤はDTTなのですが、54mg/ml（終濃度350mM）というのは反応時という意味でしょうか？ (3)前任者からもらった資料では「DTT18mgをサンプルバッファー1mLに加える」となっています。加熱操作時は、サンプル40ul：サンプルバッファー200ulで行なっていたようです。これで(2)はクリアしていますでしょうか？ (4)BIO-RADのLaemmli サンプルバッファーと比べるとTris-HClとSDSの濃度が２倍（濃い）と思うのですが、希釈する必要があるのでしょうか？ 色々質問してすみません。 教えていただけると助かります。よろしくお願いいたします。
- 締切済み
- 生物学
- アガロースによるタンパク質泳動
いつもお世話になっています。 連続して質問させて頂いて申し訳ありませんが教えてください。 アガロースでタンパク質を泳動すると、より高分子の分離がいいと聞いたのですが その場合のゲル組成、バッファー組成、またサンプルバッファーの組成を教えていただきたいのですが・・・ または、参考になる書籍等でも良いですのでご教授願います。
- ベストアンサー
- 生物学
- SDＳの結晶が電気泳動の結果に及ぼす程度について
ＳＤＳ－ＰＡＧＥでミオシン重鎖を分離しています。ＳＤＳサンプルバッファーでサンプルを作る際に、冷蔵庫からバッファーを出して、ＳＤＳの結晶が底にあったかもしれないのですが、そのまま作成し電気泳動をして、バンドが得られました。このような場合、ＳＤＳの濃度の影響はどのくらい重要なのでしょうか。サンプルを作る段階でこのようなことがあるとその結果の信頼性はかなり低いのでしょうか。よろしくお願いいたします。
- 締切済み
- 化学
