SDS-PAGEの試薬調製について教えてください

質問

学生実験の準備で困っています。前任者からの引継ぎが曖昧で、担当の先生も常勤ではないために詳しいことが分かりません。

サンプルバッファーとして、
ナカライテスクの30567-12
Sample Buffer Solution without 2-ME(2x) for SDS-PAGE
pH6.8 0.45um フィルター濾過済　組成：0.125M-Tris-HCl, 4(w/v)%-SDS,
20(v/v)%- グリセリン,0.01(w/v)%-BPB
を使用したいと思います。

(1)これは、小分けにして-20℃（-80℃？）で保存することが可能でしょうか。可能な場合、一般的にどのくらいの期間もちますか？
(2)加える還元剤はDTTなのですが、54mg/ml（終濃度350mM）というのは反応時という意味でしょうか？
(3)前任者からもらった資料では「DTT18mgをサンプルバッファー1mLに加える」となっています。加熱操作時は、サンプル40ul：サンプルバッファー200ulで行なっていたようです。これで(2)はクリアしていますでしょうか？
(4)BIO-RADのLaemmli サンプルバッファーと比べるとTris-HClとSDSの濃度が２倍（濃い）と思うのですが、希釈する必要があるのでしょうか？

色々質問してすみません。
教えていただけると助かります。よろしくお願いいたします。

回答No.2

tatoo

まず疑問に思ったのは、質問者さんはSDS-PAGEをしたことがあるのでしょうか？
ナカライの商品の使い方というよりも、SDS-PAGEのことを少し調べられた方がいいと思いました。

まず、重大な問題があります。

＞(4)BIO-RADのLaemmli サンプルバッファーと比べるとTris-HClとSDSの濃度が２倍（濃い）と思うのですが、

当たり前です。問題ないと答えている方もいらっしゃいますが、これは重大な間違いです。

このSample Buffer Solution without 2-ME(2x) for SDS-PAGEという溶液ですが、
泳動に使うときの濃度よりも「２倍濃い溶液」だからです。

つまり、

通常、SDS-PAGE用のサンプルは、何かしらのタンパク質溶解液で細胞等を溶かして「タンパク溶液」を調整します。

その後、その「タンパク質溶液」と同じ量の「Sample Buffer ２×（２倍濃い溶液）」を加えます。

例えば、
「タンパク質溶液」　100マイクロリットル
「２倍濃いSample Buffer」 100マイクロリットル
これらを混ぜます。

すると、２倍濃いSample Bufferはタンパク質溶液で薄められ１倍のSample Bufferとなるのです。

この理解をまずはきちんとして下さい。

その上で、(3)について。

基本的な作業ではありませんが、
私の経験上サンプルバッファーはそこまで厳密に濃度を守らなければならないものではありません。
どういう理由で「サンプル40ul：サンプルバッファー200ul」になったのかわかりませんが、
前任者がこだわった条件なのか、ただ素人だったのか。

いずれにしても、質問者さん自身がきちんとSDS-PAGEをまずはきちんと理解される方がいいと思います。

(1)について、
大丈夫だとは思います。ただ、電気泳動前に、サンプルを煮ることもあります。
それはどういう意味なのかということをきちんと理解されることをお勧めします。
やはり、SDS-PAGEをきちんと理解されることをお勧めします。

(2)について。
還元剤は（特にDTT）は溶液に調整すると失活しやすいと思います。
なので、用事調整をお勧めします。

濃度については、私自身どういう説明をすれば良いのか、混乱すると思いますので、
まずは、やはりSDS-PAGEについて調べられてください。

ただ、そのナカライの製品は元々、2-MEを入れるように説明書に書かれているのではないでしょうか？
もしくは、DTTの加え方も説明書に書いてあるのではないでしょうか？
そちらから調べられることをお勧めします。

いずれにしても、いろいろな参考書はありますので、SDS-PAGEを調べられて下さい。

お礼

ご回答ありがとうございました。
正直な話、SDS-PAGEを行なうような分野には属していないため、経験はゼロに近いです。ある程度基本的な原理などはもう少し学ぼうと思います。
2-MEにすべきなのか、DTTでも大丈夫なのか確認し、実験を行なってみます。

回答No.1

ga111

(1)これは、小分けにして-20℃（-80℃？）で保存することが可能でしょうか。可能な場合、一般的にどのくらいの期間もちますか？

たぶん、大丈夫です。-20℃で１-３年？

(2)加える還元剤はDTTなのですが、54mg/ml（終濃度350mM）というのは反応時という意味でしょうか？

？２－Mercaptoethanolだと、最初から混ぜて保存していますけど、DTTは知りません。流す蛋白によるでしょう。

(3)前任者からもらった資料では「DTT18mgをサンプルバッファー1mLに加える」となっています。加熱操作時は、サンプル40ul：サンプルバッファー200ulで行なっていたようです。これで(2)はクリアしていますでしょうか？

？たぶんクリア。固形のDTTを用事に混合がいいかも。

(4)BIO-RADのLaemmli サンプルバッファーと比べるとTris-HClとSDSの濃度が２倍（濃い）と思うのですが、希釈する必要があるのでしょうか？

ナカライの推奨に従いましょう。たぶん関係なし。

一般的に流す蛋白（千差万別である）や目的によるので、蛋白の名前の記載がない以上、ほとんどの場合は大丈夫ですとしか言いようがないですね。

お礼

ご回答ありがとうございました。
とりあえずサンプルバッファーは分注保存し、DTTも固形を用事添加して実験を行なってみます。