タンパクの精製をバッチ法で行っているのですが、G-sepharoseが

質問

タンパクの精製をバッチ法で行っているのですが、G-sepharoseが途中でダマになるという現象が起きています。
何か、樹脂に良くないもの等を入れてしまった（もしくは入って閉まった）のでしょうか。
どなたか、同じようなトラブルに合われた方はいらっしゃいますか。
その時どのようにして解決されたのでしょうか。

回答No.3

tir70 · ベストアンサー

KClではなくて，KIです．KIやKSCNなどは，変性剤ほど強くありませんが，タンパク質やポリマー間の相互作用を弱める効果があります．効果が出るには，0.5-1Mくらい入れる必要があるかもしれませんが．

そういう意味では，G-Sepharoseがダマになるときは，高濃度の硫安みたいなものを加えていたりしませんよね？

補足

失礼しました。KIですね。
分かりました。

硫安などは加えていません。
ありがとうございます。

回答No.2

tir70

そういえば，この件のG-sepharoseは，Protein G-sepharoseじゃなくて，GST-sepharoseでしたね．失礼しました．IgGのことは忘れてください．

確かに，GST融合タンパク質同士，あるいは大腸菌内の別のタンパク質を介したGST融合タンパク質同士の会合がひとつの可能性として考えられます．もしも，GST融合タンパク質が多量体を(n>=2)形成する性質を本来持っている場合は，回避しようがないかもしれません．

決め手となる対処法があるかどうかは分かりませんが，まずは，G-sepharoseにGST融合タンパク質を保持させるときの溶液条件において，塩濃度を上げる，そしてTriton-Xなどの界面活性剤を少し加える，といったことは，もう試していますよね？特に，添加する塩としてNaClがあまり効かなかった場合，KIあたりを使ってみるのも一案です（> 0.1 M）．でも，KIが濃すぎると，目的のタンパク質が失活するかもしれないので，程々に．

参考URL：

http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/AF3255194E7F4805C1257628001D2AAA/$file/52230300AK.pdf

お礼

ありがとうございます。NaCl、Triton等は試しました。
KClは試したことがないので、試みてみます。

回答No.1

tir70

精製の目的のタンパク質はIgG？それともIgGの抗原でしょうか？
もしも、目的のタンパク質が抗原で、しかも使っているIgGがポリクロだとしたら、現象を説明できるかもしれません。すなわち、ポリクロの場合、エピトープの異なる抗体が多数あることが考えられますので、抗原タンパク質に複数のIgGが結合し、それによって、G-sepharose同士が抗原タンパク質を介して次々に架橋されてしまう、そしてさらにはゲルがダマになる、ということがあるかもしれません。
　しかし、精製するタンパク質がIgGだったり、あるいはそうでなくて抗原であっても使っているIgGがモノクロだったら、やっぱり何が起こっているのか、分かりませんねぇ。これらの場合、案がありません。

補足

大腸菌で発現させたGSTタグ付きタンパクをG-sephaで精製しているだけなので、
特定のIgGは入っていないはずなのですが…
もしかしたら、G-sephaと相互作用しているGST-proteinがアグリゲートなどを起こしているのかもしれない、ということは考えられますか??