• ベストアンサー

PCRの条件設定について

PCRの条件設定について、伸長反応の温度と時間はどのような理由で設定されるのでしょうか? また、PCR終了後に68℃で5分の処理をしたのですが、これもどのような理由でしたのか分かりません。 できれば詳しい回答おねがいします。

質問者が選んだベストアンサー

  • ベストアンサー
  • tunertune
  • ベストアンサー率31% (84/267)
回答No.1

温度は酵素が最も適切に働く温度に、 時間は得ようとするPCR産物の長さと酵素の能力(1kb/minとか)によって設定します。 終了後の伸長時間の追加は未伸長の断片を最後まで伸ばす(完全な2本鎖フラグメントの形成)と聞いておりますが、サイクル内の伸長時間を少し長めに設定するので私はあまり気にしていません。

hana1110
質問者

お礼

ありがとうございました。 助かりました。

関連するQ&A

  • PCR法について

    増幅させたい遺伝子が変わると、PCR条件が異なり、たとえば熱変性は90~100℃で、アニーリングは60~65℃で、DNA鎖の伸長は70~75℃で行われる。これらの各操作での温度は、いったいどういう理由で定まっているのか、をおしえていただけないでしょうか? よろしくおねがいします

  • PCRにおけるTm値と伸長反応温度

    PCRにおけるTm値と伸長反応温度について質問します。 とあるメーカーのプロトコルで、アニーリングは(Tm-5)℃、エクステンションは68℃に設定するという記述があったのですが、エクステンションの温度はアニーリング温度に関係なく68℃にしていいのでしょうか?

  • PCRの最初の熱変性と最後の伸長反応

    PCR初心者です。 PCRの熱変性→アニーリング→伸長反応の流れや原理は理解しているのですが、様々な文献を見て疑問が湧いたので投稿いたしました。 PCR反応の一番最初のステップで、ホットスタートのTaqであるかどうかにかかわらず時間を長めに設定した熱変性を行い、次に通常の熱変性→アニーリング→伸長反応のステップを30サイクル程度繰り返し、最後に時間を長めに設定した伸長反応で全工程を終える、といった文献を見かけます。 この、時間を長めに設定した最初の熱変性と最後の伸長反応の意義がよく分かりません。 多くの文献で当然のようにこれらの工程が追加されているのですが、なぜ追加されているのか全く説明らしいものがありません。 どなたかご回答、お願いします。

  • PCR

    ALDH2をPCRで増幅しようと思い、実験で温度条件94℃15秒、48℃30秒、68℃10秒で行ったのですが、その温度条件の理由がわかりません。 教えてください。

  • PCRの伸長反応について

    PCRの伸長反応は,用いるDNAポリメラーゼによって僅かに異なりますが,大体70度前後だと理解しています. ところが,sequence reactionのサイクルでは伸長反応は60度と習いました. これは普通のPCRで用いるポリメラーゼとsequence reactionで用いるポリメラーゼが全然違うものだからなんでしょうか?

  • PCRについて

    PCRにおいて、1塩基のプライマーはハイブリダイズして伸長反応が起こるのか教えてください。

  • PCRのサイクル

    学生実験でPCRを行ったのですが、PCRについて質問です。 (1)94℃ 2分、(2)98℃ 10秒、(3)55℃ 30秒、(4)68℃ 50秒、(5)68℃ 2分、(6)4℃ の設定で(2)~(4)を30サイクル行いました。 (1)と、(5)の意味がわかりません。 (4)で68℃の反応をしているのに(5)でもう一度68℃ 2分を行うのは、急激に温度を下げるのを避けるためでしょうか? よろしくお願いします。

  • PCRの温度と時間

    早速質問させていただきます。 PCRをするとき、プレPCRとポストPCRをすると思いますが、(pre denatureとpost elongationでしたっけ?)その反応温度と時間は何を基準に設定していますか?おそらくDNAの長さや使う酵素によると思うのですが、いまいちどれくらいに設定したらいいのかが分かりません。酵素についてくる説明書の反応時間の例にも書いていません。 また、TAクローニングでない場合ではDNAにAを付加する必要がないのでpost elongationは必要ないのでしょうか?

  • PCR反応

    PCR反応で Denature anneling Extension の反応時間についてお尋ねします。 Extensionの時間はTaqの性能によって変えていますが、 DenatureとAnnelingの時間はどのように設定したらよいのでしょうか? できるだけ短くしたいとおもうのですが、 私は今まで30秒~60秒をなんの根拠もなく設定していました。 5秒とかでやっている人もいることを知って驚きました。 この時間の条件検討などを行った論文や実験書はあるのでしょうか? よろしくお願いいたします。

  • プライマーなしでのOverlap Extension PCRについて

    異なる遺伝子(PCR産物)を鋳型にしたPCRで、プライマーを付けずに伸長反応をさせることにより、異なる遺伝子をつなぎ合わせて、その後プライマーを入れてのPCR反応により、異なる遺伝子をつなげて増幅できると論文にありましたが、プラマーがないと異なる遺伝子が反応せずに残るのではないかという意見もありました。 このようなOverlap Extension PCR場合、サイクル数、プライマーの有無はどのようにすればよいのでしょか?