RT-PCR法の基本的なことについて

質問

すみません、RT-PCR法について伺いたいことがあります。すごく基本的なことなんですが、RT-PCRでmRNAを増やしたいときに、温度と時間を設定するようですが、この温度と時間の変化は何を見れば書いてあるのでしょうか？ある論文には細かく「何℃を何分で何℃を何分で…」と書いてあるものもあり、他の論文では「annealing temparature」のみが書いてあるものがあります。どのような本またはサイトを見れば、正確なデータが書いてあるのでしょうか？ご存知の方いましたら、是非お願いします。

回答No.2

geneticist12

使う酵素や反応液の組成、装置（さらにはチューブ）の特性に左右されます。ですから、正確にといわれても絶対的な条件というのはありません。ご自分でやる実験の計画のためでしたら、まずは、酵素と装置の添付マニュアルで推奨される条件に従ってください。

大体の目安としては
変性　94C, 15 sec.
アニーリング　プライマーのTm-5C前後（増幅量が少ないときは低めに、non-specifな増幅があるときは高めに設定）, 30 sec.
伸長　72C (long PCRの場合は68 C), 1 min x 伸ばす長さ (kb)

プライマーのTmが70C以上あるときは、アニーリングステップを飛ばして、伸長反応を68Cで。

プライマーのTmの算出法はいろいろありますが、GCの塩基数 x 4C + ATの塩基数 x 2Cで近似できます。

回答No.1

noname#13872

えと、RT-PCRをやりたいが、温度サイクルをそれぞれ何度にすればよいか分からないということで宜しいですか？
普通は購入したPCRキットに何度で何分しろと指示してあるはずです。
大体はそのプロトコルに従って行いますから、省略する場合が多いです。

とりあえずはお手元のRT-PCRキットの取説を熟読することをお勧めします。