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サザンブロットのプローブを作るんですが
(1)どのように作ればよろしいんでしょうか? (2)5'側のプローブと3'側のプローブはどちらも必要なんでしょうか? 凄い基礎的な質問をしてしまい申し訳ないと思うのですが、私が所属する研究室でサザンをやっている人がいないことや指導担当の先輩・技官さんがいないので質問させていただきました。 回答宜しくお願いします。
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サザンハイブリッド法について質問です。大学の授業で習ったのですが、 プローブ作成について、どのような塩基を作ればよいかがわかりません。 下記の問について説明していただける方、ご回答お待ちしています。 問:仮想上の遺伝病について、遺伝子Aに異常があることが分かった。 また、調べられた患者の遺伝子はすべて変異1,2のいずれかであった。 どのようなプローブを作成すれば最も効率よく正常かそうでないかを 識別できるかを考え、そのプローブの塩基配列を答えよ。(全角英字が変異している部分) 正常遺伝子A CGATCCTTGATCAGGATTTCGA・・・ 変異1 CGACTGACAGACAGGATTTCGA・・・ 変異2 CGATCCTTTCATTCAGTTTCGA・・・ 解答:ACTA(他の回答例もありましたら教えてください。)
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再回答いただけますととても助かります。 私が実施している卒業研究では、マウスの遺伝子解析(サザン&PCR)をして、条件に合ったものを交配にかけ目的のマウスを作り出すことにあります。 PCRでは目的の遺伝子領域を確認できたのですが、それだけでは遺伝子の解析としては不十分ということで、サザンをやることになり、以前質問をしました。 それで新たに質問なんですが、 ゲノムサザンではRIのほうが効率がいいのでしょうか? うちの研究室ではRIを推奨しているのですが、東京大学の核内情報研究分野ではDIGでやっても結果は大差ないとおっしゃっています。 どうなんでしょうか? CTABさんの経験的にはどちらがいいと思われますか? わたしは安全性の面などからDIGを使用したいのですが、RIをすすめられているので何とも言えない状況になっています。 またサザンのプローブの作成についてですが、 私の考えでは5'、3'側の両方のプローブを作成するためにゲノムから直接、5'、3'のプローブ領域とする遺伝子配列の外側をそれぞれ特異的なプライマーを設計し、それでPCRを行うことで目的とする遺伝子領域の断片(プローブ領域)を作成しました。 自分が設計したプライマーでの増幅はうまく成功し、ゲル抽出をして、次にシークエンス解析を行うことで正しく増幅されたかどうかを確認しようとしています(2009/1/23現在)。 この方法で作成した断片をプローブにしようと思うのですが、この遺伝断片をRI修飾、またはDIG標識をするのはどのように実施するのでしょうか? DIGではPCRの際に化学修飾された塩基をPCR反応溶液に混ぜ合わせることでPCRが終了した時点でプローブができると思われます。 しかしながらRIではそんなことができるとは思えません。 どのようにやるかどうかも教えてもらえず困惑しています。 頼れるのは自分だけという状況であり、なぜ卒業研究でまともな指導の一つも受けられないのかがわかりませんが。。。 何度も基礎的な質問をしてすいません。 実際に研究室でサザンをやっている人がいないので頼れる人がいないので質問させていただいてます。 回答よろしくお願いいたします。