- 締切済み
ゲノムサザンのコピー数
職場の研究でゲノムサザンをすることになりました。 その際のコピーマーカー数を決めなければならないのですが、よくわかりません。 研究自体は初めてで、サザンブロットという言葉すら先日初めて聞いたぐらいです。 大変申し訳ありませんがご指導のほうお願いします。 条件 元々のDNAは1μg/μlで約6000bp 元々のDNA 0.5μgを使って切り出しましたた 切り出したDNAは約1000bp 切り出して回収したDNAは現在TEに溶かしてあります 上記の中には何コピーあるのかということを悩んでいます。 自分で調べたり考えたものでは、 アボガドロ定数と1bpの分子量が650ということです。 アボガドロという知識が全くなく、考えあぐねています。 もし、全くぜんぜん違うおかしい事を言っていたらすみません。
- sakura_ski
- お礼率0% (0/1)
- 生物学
- 回答数1
- ありがとう数1
- みんなの回答 (1)
- 専門家の回答
みんなの回答
- atyushi
- ベストアンサー率50% (5/10)
DNA1bpの分子量が660 DNA6000bpだと分子量3.96×10の6乗 このDNAが0.5μgあるので 0.5×10-6(g)÷3.96×10の6乗=126×10-15 mol 元々ある これから1000bp切り出そうが、mol数は変わらない(収量100%として) 1000bpが126×10-15 mol 現在TEに溶けている。 1molあたり6.02×10の23乗個分子が存在するので(アボガドロ定数) 126×10-15(mol)×6.02×10の23乗 =75.852×10の9乗個 分子が存在している (約760億コピー) あとはテキトーに収率を考えてください。 (桁を間違えてたらごめんなさい)
関連するQ&A
- DotBlotとサザンブロットの違い
トランスジェニックマウスを業者に作ってもらい、トランスジーンが入ったファウンダーが複数取れました。 トランスジーンのDosage effectを調べたい実験系で、各ファウンダーのトランスジーンコピー数を調べる為にDotBlotとサザンブロットを平行して行いました。 トランスジーンコンストラクトの階段希釈をポジコンとし、トランスジーンをprobeでhybriさせ、期待通りのシグナルが得られています(両方法で)。ところが、サンプルの各ラインのゲノムDNAでは、例えばAラインはDotBlotでは20コピーと見積もられるのに対してサザン法では1コピー。逆にBラインはDotBlotでは5コピーなのにサザン法では20コピー。Cラインに至ってはDotBlotで50コピーあるのにサザンではシグナル0といったように、両方法で結果が一致しないのです。 DotBlotは2回、サザンは3回、independentにやり直したのですが、方法自体の結果は完全に再現性あるので手技によるブレではないと思うのです。 このような経験をお持ちの方がいらしたら、どちらの結果を信じた方が良いのか、また、原理は同じ両方法で結果を合わせるコツ等をアドバイス頂けたら幸いと存じます。よろしくお願いします。
- 締切済み
- 生物学
- ゲノムDNA溶液を冷凍保存する際のDNA濃度
抽出したゲノムを冷凍保存する予定でいます。 ただ、高分子DNA溶液を凍結保存する際は、濃度を低くしすぎない事と、 凍結融解を繰り返さない事が大事だと教科書に書いてありました。 エタ沈後のゲノムDNAのペレットを100μlのTEで溶解した後、その溶液から 6μlを取って10倍希釈したサンプルを分光高度計で計測した結果、DNA濃度は1100μl/mlでした。 貴重なサンプルなので、ある程度希釈して溶液量を増やして、そして数十μlほどに小分けして冷凍保存、という事を考えています。 ただ、実際にゲノムDNAなどの高分子DNA溶液を冷凍保存する場合、どの 程度の濃度まで希釈してもOKなのかという事がわかりません。 どなたかアドバイスいただければ幸いです。よろしくお願い致します。
- ベストアンサー
- 生物学
- 分子量のマーカー(DNAラダー)の移動度とサイズ(bp)の関係
分子量のマーカー(DNAラダー)の移動度とサイズ(bp)の関係をグラフにプロットせよ。 また,そのグラフから各々のプラスミドに組み込まれていたインサートの長さを測定せよ!!!! という問題で、分子量のマーカー(DNAラダー)の移動度とサイズ(bp)の関係をグラフにプロットせよ。はで来たのですが、そのグラフから各々のプラスミドに組み込まれていたインサートの長さを測定せよ、という問題が分かりません。どうやって解けばいいのか教えてください。そもそもインサートってなんですか?
- 締切済み
- 生物学
- 低分子一本鎖DNAに用いる共沈剤
分子生物学の研究を始めたばかりの学生です。 実験で、低分子(20~50mer)一本鎖DNAを複数回に渡ってエタ沈する必要があるのですが、 その際に用いるもっとも適切な共沈剤は何がいいでしょうか。 現在、ニッポンジーンの「ethatinmate」を使用してるのですが、 よくよく確認してみると「120塩基以上の一本鎖核酸を定量的に回収できる」と書かれていたので、、、 sigmaも共沈剤を販売しており、「20bp以上のDNAを回収できる」と書かれていたのですが、 二本鎖と一本鎖じゃ具合が違うんだろうな、と思いまして。 takaraの「とるくんキャリア」は、何mer以上なのか記載されておりません。 よろしくお願いします。
- 締切済み
- 生物学
- アガロースゲル電気泳動
PCR法で処理したDNAをアガロースゲル電気泳動をしました。 レーン1 DNA分子量マーカー(1Kbp) レーン2~レーン4 PCR産物1 レーン5 DNA分子量マーカー(100bp) レーン6~レーン8 PCR産物2 レーン1からレーン4はアプライする時にゲルにさしてしまいました。 レーン5~レーン8はアプライは綺麗にはいりました。 結果はレーン1からレーン4まではバンドが見えたが、レーン5はライトにあてるとやっとなんとか見える程度で、レーン6~レーン8は何も見えなかった。 レーン6からレーン8はPCR産物2を入れ忘れたと考えられるが、レーン5の分子量マーカーがきちんとでなかった理由がわかりません。 どのような理由が考えられるでしょうか? またアプライするときにゲルにさしてしまったことで、さしてない方に影響出たりはするんでしょうか?
- 締切済み
- 生物学
- 多糖類の多い植物からのDNA抽出法。
多糖類が多い植物からのDNAの抽出は何かポイントがあるのでしょうか? フェノール・クロロホルム抽出の繰り返しなどではだめでした。 フェノール法やCTAB法も定法ではだめで、エタノール沈殿が 終わったときにはペレットになっていても、それをTEに溶かすと、 粘性がでてしまい、吸光度も260nm付近にピークが来ません。 (できれば超遠心は使いたくないのですが・・・。) バッファーを暖めておくといい、等、裏技的な手法でもかまいません。 単離したDNAはサザンブロットに用いるグレードでとれればいいです。 どなたかご存じの方いらっしゃいましたら、よろしくお願いします。
- 締切済み
- 農学
- プラスミドDNAを電気泳動する時と吸光度測定した時との濃度差について。
土壌に含まれる微生物を特定する研究をしており、PCRを行うために細菌よりプラスミドDNAを取り出し、取れたか確認のために電気泳動を行いました。 ゲルは、1%のアガロースゲルを用い、ゲル作成時に使用した溶液と電気泳動の際のバッファー溶液は1×TAEを使用しました。 1ヶ月ほど前にプラスミドDNAを抽出し、電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色、紫外線を当て観察すると、23000bp付近にバンドが確認出来ました。 このときの濃度を吸光光度測定で計測すると、DNAの量は650μg/mlでした。 ところが最近、前回と同じ操作でDNA抽出をしたのですが、今回の場合、電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色をし、紫外線を当て観察すると、前回よりもバンドの蛍光は強くなっていました。 しかし、このときの濃度を吸光光度測定で計測すると、DNAの濃度は200μg/mlまで低くなっていました。 なぜ、このように電気泳動をした時の蛍光が強くなったにもかかわらず、DNAの濃度は下がってしまったのでしょうか? マーカーの蛍光は、前回と同じように見えました。 また、このサンプルを用いてPCR操作を行う事は出来るのでしょうか? 本を調べ、アルカリや酸で加水分解されると核酸はモノヌクレオチドになり、260nmの吸光度は高分子核酸に比べて10~15%増加するという事は分かったのですが、これが決定的な原因では無いと思います。 原因の予想がつく方がいらっしゃるなら、教えていただけると幸いです。
- ベストアンサー
- 生物学
- DNAの分子量の出し方について
PCR産物のマーカーDNA断片による分子量測定について質問です。 現在研究においてHPV遺伝子の検出を行っています。 組織片からDNAを抽出→PCRで増幅→電気泳動→エチジウムブロマイドで染色→UV照射→バンドを確認→写真をプリントといった手順で行いました。 その後、写真を用いてマーカーDNA断片とPCR産物の移動度を定規を用いて計り、片対数グラフを用いてPCR産物の分子量測定を行ったのですが、手書きで行ったため思ったような結果が得られませんでした。 いいグラフの書き方又はグラフでの分子量の測定以外の求め方を御存知の方がいましたら回答よろしくお願いします。
- 締切済み
- 生物学
- PCR後のアガロースゲル泳動について
PCRで増幅後、確認のためプラスミド精製、エタノール沈殿をしてから、TEに溶解後のサンプルを10μl泳動しました。 泳動後の結果を見てみると、とても発光が薄いバンドが見られました。(バンドが出た位置は大丈夫でした)いつもははっきり見えていたのにと思い、もう一度やってみましたが、結果は同じでした。私の研究室ではEtBrを先に入れてゲルを作っています。なにがいけないのかがわかりません。一緒に入れたDNAマーカーも薄いです。この発光の濃淡はDNA濃度とも関係してくるのでしょうか?わかりにくい質問ですみません。よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- PCRサイクル計算でのmolの考察と塩基対の関係
標的DNAとして600塩基対を増幅したい。 1分子の2本鎖から出発する。PCRにかけ、最終的に100ng以上を得たい。 その際、PCRは最低何サイクルすればよいか。 ただし、計算過程において 1ヌクレオチドの平均分子量250、log2=0.3 アボガドロ数N=6.0*10^23とする。 という問題がありました。 PCRの回数をnとして解答は (2^n/N)*250*600*2 ≧100*10^-9 となっていましたがここで質問です。 この式では当然 g ≧ gにしたい だから w/M=mol より 左辺は mol * M という形にするために (2^n/N)*250*600*2 という形になっているという根本はわかるのですがここで2つのなぞです。 たとえば O_2分子が 2つある。 この時、 O_2は何モルあるか? という問題ならば答えは 2molですよね? PCRは2^n で その結果だけ分子ができる つまりmol でいうとアボガドロ数をかけなくても 2^n = mol なんじゃない?しかも形成された分子の数という定義なんだし。と思ってしまいました。 なので何でこの 2^nに6.0*10^23を割らねばならぬのかを丁寧に教えてください。 そしてもうひとつ。 DNAの計算ではしょっちゅうでてくるのですが 250*600*2 でどうして2をかけなければならないのでしょうか。 600塩基対 とまでいわれているのだから対なわけで2をかける根本的な意味がわかりません。 bpといわれたらなおさらどうして2倍しなきゃいけないの?と考えてしまいます。 上の質問の二つはその道では問題ではなく理解というより当然のことで質問することすら恥ずかしいないようだとは百も承知でそれ以上に私もしっかりとこの問題を見てクエスチョンマークが出るような人間から解き放たれたいです。 (1)分子数ってことは = mol ではなぜいけなくてNで割るのか? (2)この計算でなぜ600*2で二倍しているのか 急ぎではないので丁寧に解説していただける方ご指導お願いします。
- ベストアンサー
- 化学