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PCRの種類
1fan9の回答
- 1fan9
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Long PCRとか、Tmの高いプライマーでPCRするときの話でしょうか。 この場合、プライマーのTm値が70度前後の場合が多いと思います。 touch-down PCRではアニーリングの低温のステップを省き、Predenature (94℃)1サイクル後、 ↓ Denature (98℃) Extention (68℃や72℃) を25~40サイクル ↓ 予備伸長68℃や72℃ というような感じだと思います。 変性denatureと伸長extention(プライマーのTm値が高いのでアニーリングannealingも同時に行える)の2ステップで行います。 step down PCRでは非特異的な断片を極力さけるために、 はじめはExtention温度を高めに徐々に下げていきます。 KOD系のLong PCRの場合、以下の感じのようになります。 プログラムとしては長いです。 Predenature (94℃)の後、 ↓ Denature (98℃) Extention (74℃) を5サイクル ↓ Denature (98℃) Extention (72℃) を5サイクル ↓ Denature (98℃) Extention (70℃) を5サイクル ↓ Denature (98℃) Extention (68℃) を15~25サイクル程度 ↓ 予備伸長68℃ Long PCRの際のTm値は、最近接塩基対法で求めたものの場合が多いと思います。
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