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cDNAライブラリー作成について ZAPベクター
ebikichiの回答
- ebikichi
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私自身やったことがないので、、、、(隣で見てはいましたが) ZAPベクターの場合 あまりインサートの確認はしないのではないでしょうか? 予想されるインサートの長さはどれくらいですか? ファージミドの長さはどれくらいですか? 泳動で差は出るにしても インサートの長さまで示唆できるでしょうか?(吸光度も同じです) 一番大事なのはRNAの質 second strand cDNAの質です インサートの平均長が知りたい場合はsecond strand cDNAを定量すべきです(この場合量が少ないのでアイソトープを使うと思います) ライゲーション効率を知りたい場合はb-galでB/Wができるはずです いささかの自信もありませんが、お答えがないようでしたので回答したしました 失礼いたしました
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早速のご返答ありがとうございます。 ZAPベクターインサート確認についてですが、パッケージング後に、ebikichiさんのおっしゃられているライゲーション効率を知るのと同様にBlue-Whiteでインサートのある程度の確認はできると思います。また、その後にwhiteの部分をさらにスクリーニングを続け、最終的にはin vivo Excisionによってファージミドを作成し、その際にPCRを用いたインサートの確認を行うのですが、前回この通りにWhiteだったのを行っていったのですが、最後のインサート確認PCRで全く入っていないという結果になってしまっていました。このため、その前段階での確認も必要なのではと思い、今回の質問になった経緯です。 また、インサートサイズについては、だいたい500から600bp位のものを予想していますが、実は目的のcDNA自体の大きさがはっきりしていないのではっきりはわかりません(わかりにくい表現ですみません。つまりまだ未知のものをターゲットとしてライブラリーを作成しようとしているので…。) 多分ベクターの長さがだいたい600bp位であるということから、インサートが入っていれば泳動に差ができるのでは、という意見なのだと思うのですが…。 ややこしくなってしまって申し訳ありません。