PCRにSDSやデムソーを添加したい

質問

RT-PCRを行っているのですが、きちんと増えないので困っています。
サイクルを振ってPCRを行ったところ、サイクルに応じてバンドが増えていなかったり、まったく増幅していなかったりします。
また、300bp付近（1kbpラダーで500bpよりも下を眼で判断）に、もやもやっとしたバンドが見えます。
もちろん、アニーリング温度の変更などもためしましたが、効果はありませんでした。

ポジコンはきちんと増えるので、操作上のミスやtempleteがおかしいということはないと考えております。

そこで、PCR反応液にSDSやデムソーを添加すればうまくいく場合があるということを聞きました。
が、添加する量などがわかりません。ご存知の方、よろしくおねがいします。
また、そういった情報の載っている文献や教科書等があれば、あわせて教えていただきたいです。

よろしくおねがいします。

回答No.7

komii

インビトロジェンのスーパースクリプトを使っているなら失敗はないと思います。しかし、RNA処理はしたほうが無難です。
うまく行かなかったときは、配列をアライメントをかけまして、もう一度、プライマーを作り直します。プライマー部分に変異はありませんか?また、テンプレートの濃度が低いということはありませんか?＝nestedPCR
私の経験なのですが、反応液に対してDMSOを1～10％入れるとバンドが見えるようになったことがあります。また、10％以上入れますと、酵素の邪魔をするので、考慮する必要があります。ちなみに、元から反応液に混ざっているやつも販売されています。
また、BetaineはSIGMAからPCRグレードで販売されています。08M～1Mの割合で入れます。
DMSOとBetaineに差があると思ったことはありせん。
他にも添加物はアルブミンなどあります。Promegaという会社のテクニカルノートに載っていますので参照してみてください。
また、使う反応液ですが、マスターミックスとして販売されているものを使ったほうがいい結果がでるという経験があります。
あと、プライマーの長さですが、長いほうが非特異的な反応が出にくいと思います。私は、非特異が出て困ったときに40bpのプライマーを使って、非特異反応を抑えることができた経験があります。
あとは、マグネシウム濃度は変えてみましたか?

補足

返事がおそくなりもうしわけございません。

大変参考になりました。
DMSOでだめなら、アルブミンやベタインもやってみます。
マグネシウム濃度の検討も行わないとダメですね。

それでダメなら、コンどこそプライマーを変えます。

回答No.6

Chicago243

No4のかたの意見に私も賛成です。DMSOの添加など一通りやるのには1日ぐらいですむと思いますのでやってバンドが出なかったらプライマーの検討に入った方が早いと思います。私の場合はアニーリング温度を振って酵素は2種類ぐらい違うメーカー, 種類のものを使って、増える気配がなかったらすぐプライマーを変えます。たいていの場合はフォアードとリバース2種類用意して4つの組み合わせが最初からできるようにしてプライマーを注文します。少し内、外側にずらすとかできないですか?あと好みかもしれませんが、長めのプライマーを私はなるだけ使うようにしてます25-30merです。

お礼

ありがとうございます。

実はもうひとつプライマーを設計しておりまして、そちらのほうでは非特異がかなり出たために使い物になりませんでした。
そこで、さらにプライマーを構築しなおすよりも、一度PCR操作に変更を加える方法をとろうかという結論に至りました。

DEMSO、SDS、ベタイン、PEGなどを試した後、NO4さんやNO6さんのおっしゃるとおり、プライマーを構築しなおそうかと思います。

回答No.5

kenji000128

No4です。
あなたの使用されているポジコンというのは別のプライマーなのですね。今回の実験のプライマーできちんと増幅するかどうかは検証されていないのでしょうか？
それなら考えられる可能性は多数あります。
・目的遺伝子が発現していない。
・プライマーの合成ミス
・多形の為、使用しているプライマーがマッチしていない。
・プライマーのデザインが不適切で機能しない。

補足

ありがとうございます。

cDNAをtemplateに用いた場合は、このプライマーで合成されますし、RT-PCRの場合、PCRを行うたびに、増幅したり増幅しなかったり、あるサイクルだけ増幅しなかったりという結果になりますので、プライマーの合成ミスや目的遺伝子が発現していないということはないと思います。

プライマーデザインは複数人でチェックしているので、大丈夫だと思います。

プライマーがマッチしていない可能性はもちろんありますが、今のところまずPCR操作に変更を加えてから、それでもダメならプライマーを変更しようと考えております。

回答No.4

kenji000128

ＰＣＲがうまくいかないときの原因の９０％はプライマー配列です。反応条件を検討するより、とっとと再合成するのが解決の近道です。
ＰＣＲの条件は特殊な場合を除いては変更する必要はありません。

ポジコンと書かれてありますが、どのようなポジコンですか？
本当に系を保証するものですか？
ポジコンといってもいろいろ考えられます、うまくいかない原因を考えて、それを検証できるポジコンをいくつかおいて検討されては如何でしょうか？

今の状況で反応条件をふると泥沼化するように思います。

お礼

プライマー配列の見直しも行いたいのですが、イントロンとエクソンの配列上、できればこのプライマーを用いておこないたいのです。

ポジコンはＮＯ３さんのお礼にも書いたとおり、ＲＰ４９というタンパク質を増幅させるプライマーを呼んでいます。

１本のチューブにサンプルを作成し、それを数本のＰＣＲチューブに分注して、サイクルを振っているのですが、サイクルに応じてバンドが増えていかなかったり、あるサイクルだけ、まったくバンドがなかったり・・・。

おっしゃるとおり、すでに泥沼です

回答No.3

gori8063

断片的な実験結果を拝見する限り、問題はPCRの反応液組成であるとは思いにくいのですが。

まず、
＞ポジコンはきちんと増えるので、操作上のミスやtempleteがおかしいということはないと考えております。

が説得力がないです。
RT後に増やす領域のDNAポジコンが増えるのであれば、奇しくもPCR反応に問題ないことを示しています。一方、RTを行った試料で増えないのであれば問題は「試料」にあることになります。

ポジコンにRTを行った溶液を混合して増えるのであればRTの結果がうまくいっていないかそもそもRTで産物がない。
ポジコンにRTを行った溶液を混合して増えなければRT後の溶液に何かしらのPCR反応を阻害する物質がある。

ということかと思います。
RTをみなおす必要があると思いますがいかがでしょうか？

補足

ありがとうございます。

ショウジョウバエ抽出RNAからRT-PCRを行っているのですが、ＲＰ４９を増幅させるプライマーをポジコンとしています。

ゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＰＣＲを行ったことはないのですが、cDNAをテンプレートにするときれいに増幅します。

そのため、最初はRTの見直しを検討しましたが、あまりよい結果が得られませんでした。RP49がきれいに増えることから、RTではなくPCRの方に問題があるのかと、考えがいたったわけです。

回答No.2

Chicago243

RTのあとにRNaseH処理をしてないならやってみてはどうですか。ただしRNaseH freeのRT酵素を使っている場合ですが。たいていの場合必要ないですが、たまにいい結果をもたらします。
DMSOは5-10%で使えば良いと思います。これもたまに改善されることがあります。
SDSはあまり話を聞きません。強力な変性剤ですから、、、、非常に低濃度ならいいのかもしれませんが、、0.01%とかでしょうか(いいかげんにこたえてます)
あと、伸長反応の時間を少し長めにとるのもやってみるといいかもしれません。

お礼

ありがとうございます。
伸長反応は1minを1.5minに伸ばしてみたのですが、かわりませんでした。
あと、変性温度を95℃にしてみたり・・・。

DEMSOは5-10%で検討してみます。
SDSはやはり0.01%くらいが妥当なんですかねぇ。
どこかに文献でもあればよいのですが・・・。

補足

お礼に書き忘れたので、こちらで失礼します。

RTはinvitrogenのSuper ScriptIIを私用していますので、RNase処理はしておりません。
が、いい結果が出たということですので、一度試してみたいと思います。

回答No.1

shimuraushiro

私はDMSOやSDSは使ったことはないですが、
ベタインを入れてPCRを行って出なかったバンドが
出た経験があります。

参考URL：

http://www.arbrown.com/product/speciality_chemicals/dna/pcr/03.html

お礼

ありがとうございます。

ベタインも聞いたことがあるので、さらなる手段として考えてはおります。
その場合、何％ぐらい添加するものなのでしょうか。
よろしければ、おねがいします。