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大腸菌のコロニーについて
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- ga111
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原理を充分に理解して、やってください。 註：α-complementationについてプラスミドベクターpBluescriptは、組み換えを起こさなければ正常なβ-galactosidaseのアミノ基側のポリペプチドをコードする遺伝子を持っている（lacZ）。β-galactosidaseの残りのカルボキシル基側をコードする遺伝子を染色体DNAあるいはF因子などのプラスミドにもつ宿主菌に形質転換させることができれば、この二つのポリペプチドが共同してβ-galactosidaseの活性をもつ。今回は、JM109株を宿主菌として使用したが、F因子にlacZΔM15を持っている。
- dadachan
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簡単に言うと、 1．cloning vectorにtransfectionしたい遺伝子のfragmentを入れた 2．そのベクターを、JM109 compitemt cell(E.coli)にtransfectionした 3．Amp, X-Gal, IPTGを含むアガロースゲルに塗布し、37℃で培養した 4．次の日に見たら、青白のコロニーが生えてて白が大きかった ですよね？ よくある事ですよ。 逆もまたあります。 私の回答は、cloning vectorに入れたfragmentが大腸菌の成長に影響する事がある、ということでした。 また、白のコロニーでさえ、大きさが違うコロニーがたくさんあると思います。 とりあえずmini prepして、制限酵素処理、あるいはsequenceしてみたらいかがでしょうか？ 数をこなしていくうちに、なんとなくどの大腸菌には入っている、ってことが”感で”分かってきますよ。 plasmid vectorというよりは、vectorに入れたfragmentによる影響の方が大きいと思いますよ。 中にはどうしても大腸菌に入れると大腸菌由来の遺伝子がfragment内に入ってきてしまって困る、という遺伝子もありますからね。
お礼
ありがとうございました！！ よくわかりました☆☆
- dadachan
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insertとの相性によって大きさが変わる事はありますね。 私の経験からでは、コロニーの小さいものの方がきちんと入っていたりしますね。 青いコロニーは、insertが入っておらず、cloning vectorそのものであるために何の影響も受けずに一定の速度で成長しますが、PCR fragmentなどのinsertが入っているとやはり成長にも影響を受けますよ。
補足
回答、ありがとうございます！ 質問を実験書なしに書いてしまったので、補足させてもらいます。 プラスミドＤＮＡの調製と制限酵素消化という実験をしました。 疑問に思ったことは、その第一段階の「プラスミドの大腸菌への形質転換」のところです。 培地の調製は、培地パウダーに蒸留水を加え、アガロースを加え滅菌・冷却したあと、Ampicillin、X-Gal、IPTGを加えプレート培地を作成しました。 形質転換は、プラスミドベクター、JM109 Competent cellを混ぜた細胞液をプレート培地にまきました。 37℃で一晩インキュベートしたら、青いコロニーと白いコロニーができており、青いコロニーのほうが小さく、白いコロニーの方が大きかったのです。ここで、何でコロニーの大きさが違うのかなと疑問を持ったわけなのです。 回答してくださった文への、私の解釈が違ったらすみません。 挿入したプラスミドベクターが何らかの影響を受けているため 青のコロニーの方が小さかったということでしょうか？
- ga111
- ベストアンサー率26% (247/916)
プラスミドのアルファComplementationのこと？ システムによって違ってきます。 上のシステムですと見かけ上、青の方が小さくみえることがありますけど、、、 また発現による選択ですので白、上のシステムですとポジティブクローンの方が生育に有利ということがあります。（よってプラスミドに何が乗っているかでも変わります。）その辺に言及されるといいかも
補足
回答ありがとうございます！ α－Complementationってどういうものなのですか？？ 調べてはみたのですがちょっとよくわからなくて・・・ 後半のほうの、プラスミドに何が乗っているかでもかわるっていうのは、その可能性あり！ではないかと思います。そこら辺も考察してみようと思います☆
- lone_lynx
- ベストアンサー率41% (78/188)
えーと ほんとに全部大腸菌ですか？ コンタミしてません？ X-GALはβガラクトシダーゼの合成基質ですから、コロニーが青くなるということはβガラクトシダーゼ（＋）ということになります。コロニーが白いということは、その逆でβガラクトシダーゼ（－）。 端的に言うとその二つは違う菌種と考えられるのですが．．．
補足
回答、ありがとうございます！ 多分、全部大腸菌でした。 どのプレートもそうなっていたので変なものは混ざっていないとおもうのですが。。 でも、その可能性もあるってことですよね～。。 それについても考察してみます☆
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お礼
ありがとうございました！！ 原理がちゃんと理解できました！ 参考のほうもすごく役に立ちました☆