- ベストアンサー
大腸菌の形質転換
- みんなの回答 （4）
- 専門家の回答
質問者が選んだベストアンサー
詳しい発現のメカニズムは、lacZの話はかなり教科書的なことなので、教科書等できっちり理解される事をお勧めします 何事も中途半端な理解は危険です。 その勉強をされた上でのお話しになるのですが、私の経験上の話です。 いろいろな遺伝子発現の調節は、ほんの少しルーズなところがあると思います。実験的にも、いろいろな遺伝子発現調節機構を利用しますが、完全に、100%スイッチON/OFFはできません。若干もれこみます。 つまり、理論上はこうだけど、よくわからなけど、ちょっと発現していたもんだから薄く青色になったじゃないですかね。 ＃２さんがおっしゃっている「促進する」というのは違うと思います。 前述の通り、遺伝子発現機構は少しルーズなので、ガラクトシターゼは結果的にほんの少し常時発現はするでしょうが、それはあくまでイレギュラーです。結果的に私も＃２さんも、ガラクトシダーゼが発現している言っているので、ニュアンスが違う程度に思われるかもしれませんが、その違いは大きいと思います。
その他の回答 (3)
- geneticist12
- ベストアンサー率67% (701/1045)
#２です。記憶違いを訂正します。 lacレプレッサーはgalactosidaseなどとは別のプロモータから常時発現するのでした。
お礼
ありがとうございました。
- geneticist12
- ベストアンサー率67% (701/1045)
たしか、lacオペロンのlacプロモータは常時発現（constituive expression)して、beta-garactosidaseとリプレッサー（lacプロモータを抑制する）を産生します。 ラクトース（IPTGはそのアナログ）存在下で、それとリプレッサーが複合体を形成すると、プロモータに結合して発現を抑制することができなくなるので発現が促進されます。 つまり、lacオペロンは発現している状態がデフォルトで、普段はbeta-garactosidaseを発現すると同時にリプレッサーを発現しているので、結果的にbeta-garactosidase発現が抑制されているのに過ぎず、発現がゼロではありません。IPTGは発現を開始するためではなく、促進するためにつかうわけです。蛇口をひねるようにall or noneにはならないでしょう。
- A-Tanaka
- ベストアンサー率44% (88/196)
大腸菌を下に戻したわけですよね？ つまり、X-Gal（5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside）を含んだ培地を大腸菌が食べて、分解したことによって、β-ガラクシターゼを生成したわけですよね？ よって、β-ガラクシターゼは、薄青色の色を呈しますから、それを検出しただけでは？
補足
IPTGがないとβ-ガラクトシダーゼは合成されないのではないのでしょうか？ そのためIPTGがないX-galのみの培地では、X-galの分解は起こらないのではないのではないかと解釈していたのですが・・・。
関連するQ&A
- 大腸菌の形質転換について
先日、「大腸菌の形質転換」の実験をしました。 pUC系プラスミドを用いました。 ＜使用した培地＞ (1)LB培地のみ (2)LB培地＋アンピシリン (3)LB培地＋X-gal (4)LB培地＋アンピシリン＋X-gal ＜予想＞ ・-DNA (1)白 (2)- (3)白 (4)- ・+DNA (1)白 (2)白 (3)青 (4)青 ＜結果＞ ・-DNA (1)白 (2)- (3)白 (4)- ・+DNA (1)白 (2)- (3)白 (4)白 ＜予想＞は合っていますか？ ＜結果＞では、なぜ(2)が-なのに(4)では菌は生えたのでしょうか？ 形質転換自体は失敗してコンタミしたのでしょうか？
- 締切済み
- 生物学
- 大腸菌の形質転換の実験について
大学生です。 現在、大腸菌に形質転換を行い、その組み替えたDNAの種類を見分ける実験をしています。プラスミドDNAには、アンピシリン耐性の遺伝子と、ラクトースオペロンＺの遺伝子が組み込まれています。 そこで、気になった事について質問したいです。 まず、形質転換した大腸菌を培養したのですが、そのコロニーについて ○どうしてコロニーは丸形なのでしょうか？ ○たまにひょうたん形をしたコロニーがいますが、なぜでしょうか？ ○また、そのコロニーを楊枝でつつき、LB培地で培養したのですが、 つついた楊枝にはどれ位の大腸菌がついているのでしょうか？ ○大腸菌を旋回培養する際、目(目はないが)がまわらないのでしょうか？ ○そもそも、LB培地の役割は何なのか ○組み替え率と形質転換率を調べるには、なんの数値を参考にしたらよいのか 質問が多くて申しわけありません。調べてもわからなかったので、よろしくお願いします。
- 締切済み
- 生物学
- 大腸菌の形質転換(lacオペロン)について
ラクトースやIPTGの有無にも関係なく、lacZ活性を示した遺伝子型の異なる二つの大腸菌に対して、lacIをプラスミドベクターにのせ導入したら、lacZ活性が見られるか実験を行いました。 この実験の前には、形質転換してない状態でのlacZ活性を確かめるためONPGによる発色で活性の評価を行ったのですが、今回の形質転換の評価にはX-Galを使用しました。 どうしてONPGではなくX-Galを使ったのか、ONPGよりX-Galに利点があるのでしょうか?X-Galを使用した理由がわかりません…。ご回答をお願いします。 また、できればでよろしいのですが、ラクトースオペロンの発現機構を確かめる実験の方法について、良いHPや本をご存知でしたら教えていただけないでしょうか??というのも、生化学などの参考書を当たっても、ラクトースオペロンの遺伝子の発現機構などは載ってるのですが、超基礎すぎて実験法などがなかなか載ってないのです…
- ベストアンサー
- 生物学
- 大腸菌の形質転換について質問です。
大腸菌の形質転換について質問です。 X-GalとIPTGと形質転換した大腸菌をまいたところ、青コロニーが全く出ませんでした。 この原因は何が考えられるのでしょうか？ 自分の中で一つ気になるのは、PUC19ベクターを使ったのですが、ベクターを調整した後電気泳動でベクターを確認したところかなり薄かったことです。 もし、ライゲーションした時にベクターが全く入っていなかった状態だと、コロニーはどのようなものが現れるのでしょうか？ 何かわからないことがあれば、補足させていただきますので、質問の回答よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- 大腸菌の形質転換とアンピシリン
大腸菌の形質転換実験を行いました。 大腸菌のコンピテンとセルにプラスミドを導入させ、それをアンピシリン含有LB寒天培地で培養しました。 培養後、形成されたコロニーを採取し、次は、坂口フラスコ内でアンピシリンを加えた液体培地で培養しました。 ここで、培地にアンピシリンを添加する理由を教えていただきたいのです。 LB寒天培地にアンピシリンを添加するのは、プラスミドを導入した大腸菌のみを培養するためだと思います。 では、坂口フラスコでの培養でアンピシリンを添加するのはなぜでしょう？自分なりにいろいろ調べたところ、「プラスミドを抜け落ちないようにするため」ということを知りましたが、これはどういうことなのでしょうか？ なぜ抜け落ちるのか、なぜアンピシリンを添加すると抜け落ちないのか、ということがよくわかりません。 ご存知の方は教えて下さい。よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- PCR反応における、形質転換について
PCR反応における、形質転換効率と、組換えDNA作成による形質転換効率の度合いについての質問です。 今回の実験では、PCR反応をしていく上で、ベクターにDNA断片を挿入すると、ベクター上のβーガラクトシダーゼ遺伝子が破壊されるため、本来なら、この遺伝子の働きによってX-galという成分が破壊されてできるはずの青色の色素が合成されずに白色になる…とあるのですが、コロニーの色素がほぼ白色になっていました。 中にはコロニーの中心点にわずかながらですが青色がところどころのコロニーに点在し、どのような反応が起こったことでこのような反応になったのかがわかりません。 あるサイトでは以下のように記載されていたのですが、なんとなく理解できないので、詳しく解説してもらえたら助かります。 よろしくお願いします。 全部白（すべてに外来DNAが挿入され、形質転換もされている） ↑これは納得できます。 白と青（挿入されないものもあるがほとんどに外来DNAが挿入され、形質転換もされている） ↑形質転換されるときにベクターの反応が何らかの理由により形質転換されておきるものだと思います。 全部青（外来DNAは挿入されなかったが形質転換はされている） ↑これが一番のなぞです。うちの実験の解説では、X-gal（元は無色）をβーガラクトシダーゼが酵素活性することで加水分解しコロニーが青色に沈着するはずですが、いったいどういうことなのでしょうか？ そもそも、この実験では、ベクターを挿入することで白色のコロニー（組換え体）を生成することに焦点を置いているはずで、青色のコロニーを生成することに焦点を置いていません。ですから、外来DNAが挿入されていないから白色コロニーを生成できなかった、だから形質転換できていないはずなのではないでしょうか？
- ベストアンサー
- 化学
- 大腸菌の形質転換を利用したクローニング
先日実験で、大腸菌の形質転換を利用したクローニングを行いました。 集菌と科学的処理 (1)大腸菌の培養液を氷上で冷却した。 (2)培養液5 mLを遠沈管に移し、3000 rpmで5分間遠心した。 (3)大腸菌のペレットを崩さないように上側にして、培養液の上澄みをデカントして捨てた。 (4)あらかじめ冷やしておいた形質転換用溶液（TSS）500 nLにDMSOを25 nL入れて、混ぜた。 (5)(4)を500 nL加えた。 (6)ボルテックスで穏やかに撹拌して、ペレットを縣濁した。 (7)懸濁液を100 nLずつエッペン管に分注して、形質転換に用いた。 (8)ライゲーション反応のDNA溶液を5 nL加えて、指先で軽く撹拌した。 (9)氷上に14:05～14:25頃まで放置して、DNAを取り込ませた。 寒天培地への植え継ぎ (1)DNAを取り込ませた大腸菌に500 nLのLB培地を加えた。 (2)37℃で15～60分インキュベートして、抗生物質耐性遺伝子が活性化するのを待った。 (3)別の遠沈管に大腸菌を50 nL移し、BL培地を250 nL加えかさあげした。 (4)それぞれの遠沈管に40 nLの100 mM IPTGと40 nLの40/mL X-galを加え、軽く撹拌した。 (5)100 ng/mLのアンピシリンを含むLB寒天培地2枚に、それぞれの遠沈管の大腸菌を撒いた。 (6)滅菌したスプレッダーで水気がなくなるまで満遍なく広げた。 (7)37℃の気相インキュベーターに入れて、一晩放置した。 このような手順で実験を行ったのですが、全くコロニーが出来ませんでした。 なぜでしょうか？ よろしくお願いしますm(__)m
- ベストアンサー
- 生物学
- サテライトコロニー内の菌の形質について
おはこんばんちわ。 高校の授業で遺伝子工学の実習をやっているのですが、 どうしても気になることがあったので、質問させていただきます。 大腸菌にpUC19を導入し、アンピシリンとX-gal・IPTGによる大腸菌形質転換の実験を行いました。 その後、アンピシリンを含んだ培地で数日間培養したところ、青色のコロニーの周囲に白のサテライトコロニーが確認できました。 コロニーの色が変化しなかったことから、サテライトコロニー内の大腸菌ではLacZが働いていないという結果になりました。 この時、サテライトコロニーの大腸菌は完全にpUC19を含まないものだと証明できるのでしょうか？ 仮説の証明としてレポーター遺伝子をpUC19に導入するという実験方法を考えましたが、予想される結果には遺伝子が正しく導入されていない可能性も含んでしまうと言うことで、完全には証明できない、とのことでした。 サテライトコロニーが起こる理由と考えられる全ての例を挙げようとすると、無数の実験をしなければいけないということになると思うのですが… これは証明できる方法があるのでしょうか、もしくは完全には証明できないのでしょうか。どなたかご存知でしたら教えてください。よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
お礼
ありがとうございました。