in situに用いる固定液について
- in situ hybridizationを行う際の固定液について、質問をしています。
- ホルムアルデヒド固定ではなく、アルコール固定のみでもRNaseの失活は期待できるのか疑問です。
- ホルムアルデヒドの作成が面倒であり、浸透性への影響も心配しています。アルデヒド固定を省くことは可能なのか相談しています。
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in situに用いる固定液について
現在in situ hybridizationを行なおうと思い、色々本を読んでますが、固定液について質問です。 成書には、とにかくRNaseフリーにするために、DEPC処理とか、乾熱滅菌とか色々書いてありますが、経験者によると、実際はそれ程気にしておらず、特にRNaseについて気にしてないようでした。 では組織が持つ内因性のRNaseはどう気をつけてるの?と聞いたら、アルデヒドで固定する為に、気にしないレベルになっていると思う、との答えでした。 さて前置きが長くなりましたが質問です。 普通in situの固定にはホルムアルデヒド固定を行い、架橋結合により併せて酵素も失活出来ると思いますが、アルコール固定のみによる変性固定では、RNaseの失活は期待できないでしょうか? 質問の意図としては、ホルムアルデヒドを作るのが面倒なのと、架橋によるプローブの浸透が阻害されるような気がするので、アルデヒド固定を省くことが出来れば、いろいろ良いことがあるんじゃないかと思ったのです。 面倒ですが、どなたか示唆を頂ければありがたいです。
- kudann2001
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RNaseの最大のソースは材料の生物組織です。それでもRNAのISHができるのは、固定によってRNaseが失活するからです。固定標本を得るまステップまではRNase-freeにこだわる必要はありませんし、その後も普通にきれいな器具、試薬を使えば組織中のRNAが分解されるほどのRNaseのコンタミはまず起こりません。 ネガティブコントロールのために標本をRNase処理したものを使うという方法もありますが、なかなか効いてくれないものですよ。 アルコール固定は単なる脱水による固定なので、組織中のRNaseの失活は全く期待できません。それができるなら、RNAの取り扱いがどれだけ楽になることか。。。 ちゃんと固定をほどこした上で、界面活性剤、有機溶媒(DMSOなど)やプロテアーゼなどで処理して、プローブの浸透やターゲットRNAの暴露を高めます。
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