ゲル濾過について。

質問

SephadexG-15とUV(254nm)検出器を使用して、ゲル濾過を行っているものです。
ゲル粒子内溶媒量(Vi)を求めるために、アミノ酸であるロイシンまたはグリシンを流そうと思っているのですが、UV吸収がないので困っております。
文献などによる調査の結果、ニンヒドリンによる発色でUV吸収が出てくるかも知れないという考えにいたりました。
しかしゲルに色素が吸着しそうで、不安です。
この方法で本当に大丈夫でしょうか。どなたか分かるかたおられましたらよろしくお願いします

回答No.2

lone_lynx · ベストアンサー

＃１です。ごめんなさい前言撤回ですm(_ _)m

HPLCだとばかり思ってしまいました。
中圧のゲルろ過でUV254で見るんでしたね。

ポストカラム反応法では、反応ループの温度を上げなければいけないですし、UV254では無理でしょう。吸収極大は570nmです。

でちょっと調べたんですが、UVでアミノ酸を検出する手法は見つかりませんでした。
また、ニンヒドリンについてですが、反応でできた青色の物質にアミノ酸は含まれませんです。つまり、１級アミノ酸とニンヒドリンの反応でできる青色物質は、アミノ酸の種類にかかわらず同じと言うことです。

質問者さんのprotcolでは、あらかじめアミノ酸とニンヒドリンを反応させて、発色したものをカラムに流すということではないですか？その場合、仮にUV254でピークが出たとしても、その量でボイドボリュームは出せないんじゃないでしょうか。

すいません、お役に立てず．．．（汗

補足

>質問者さんのprotcolでは、あらかじめアミノ酸とニンヒドリンを反応させて、発色したものをカラムに流すということではないですか？その場合、仮にUV254でピークが出たとしても、その量でボイドボリュームは出せないんじゃないでしょうか。

ご解答ありがとうございます。実験方法はおっしゃってくださっている通りです。しかし私が求めたい値はゲル粒子内溶媒量(Vi)です。排除限界である分子量1500のゲルならアミノ酸の分子量(およそ200以下)を使えば、ある程度の値は求められると考えました。

しかし解答を待っている間に自分なりに調べたところ、やはりおっしゃるとおり、UV吸収剤などを使わないとアミノ酸はUV吸収では検出できないようなことが分かってきました。

別の方法としてフェノールなんかを流せば、UV吸収もあり分子量も小さくViが求められそうなんですが、どうでしょうか。ゲルがおかしくなったりしないでしょうか。

長々すいません。

回答No.4

takakokoreo

254nmのみですか～．

それだったらフェニルアラニンの極大吸収にちかいですね．
あとDNAとか．

回答No.3

takakokoreo

チロシンではどうですか？UV吸収がありますけど．

補足

ご解答ありがとうございます。
254nmでも大丈夫でしょうか。私が使用している検出器はその波長でしか測定できないので。

回答No.1

lone_lynx

ポストカラムで反応させてはいかがですか？

つまり、カラムと検出器の間に反応液（この場合ニンヒドリン）を送り込む方法です。
移動相と反応液の流量を同じにすると逆流やピークの乱れを防ぐことができます。
この場合、等量混合になりますから、インジェクションしたアミノ酸の量にあわせて反応液の濃度を調整してください。
あれ？ニンヒドリンて単独でUV吸収持ってませんか？
可視光で青の吸収見たほうがよさそうですよ。