ＤＮＡのエチブロ染色について

質問

エチブロ染色の原理は、二本鎖DNAの内部にインターカレートしたエチブロ分子を持つと、吸収したＵＶ光のエネルギーをエチブロに渡し、励起されて590 nmの蛍光を放射し、それを検出することで二本鎖DNAのみの存在が分かるということでした。詳細には、エチブロの本来の吸収波長は300 nmで核酸は260 nmであり、300 nmの波長をあまり含まない260 nmの波長で励起することで、遊離したエチブロは励起されず、二本鎖に挟まったエチブロのみが光るということでした。疑問に思ったのは、二本鎖DNAは260 nmの波長で励起されると300 nmの波長を放射するのでしょうか？よってこの300 nmのエネルギーをインターカレートしたエチブロに転移することができるのでしょうか？二本鎖DNAが、ゲル中で300 nmの波長を放射すると、別にインターカレートしていなくても遊離状態のエチブロにも届いて励起することができてしまう気がします。いまいち起こっている波長のやりとりがよく分かりません。
よろしくお願いします。

回答No.1

Mr_Spock · ベストアンサー

>二本鎖DNAは260 nmの波長で励起されると300 nmの波長を放射するのでしょうか？

違います。DNAがエネルギーを吸収しやすい260 nmで励起すると、その励起エネルギーがインターカレートしているEtBrに直接転移されてEtBrが蛍光を発します。励起エネルギー転移（excitation energy transfer)という現象です。DNAとEtBrが複合体を作っていてあたかもひとつの分子のなかの励起エネルギー吸収団と蛍光団のようにはたらきます。

>ゲル中で300 nmの波長を放射すると、別にインターカレートしていなくても遊離状態のエチブロにも届いて励起することができてしまう気がします。

核酸のEtBr染色の検出方法としては、核酸の吸収波長ピークの260 nm付近の短波長UVで励起する方法と、300付近あるいは350付近だったかのEtBrの吸収波長ピークの長波長UVで励起する方法が両立して使われます。
短波長の方がフリーのEtBrが光らず、蛍光強度自体も強いので観察には向いていますが、核酸が吸収しやすい波長であるために核酸が傷みます（チミンダイマー形成や切断）。そのため、切り出して精製するような場合はEtBr自体の吸収波長ピークの長波長UVで励起するのが好まれます。

長波長で励起するとフリーのEtBrもインターカレーとしたEtBrも光って、核酸が検出できないのではないかというと、そうではありません。
フリーのEtBrは周囲の水分子にクエンチされて蛍光が減弱します。ところが核酸にインターカレーとしていると周囲の水分子が締め出されるために減弱が起こらず、フリーのEtBrより一桁以上強い蛍光を発します。そのほかにも核酸にインタカレートすることで核酸があるところだけにEtBrが蓄積するということもあります。

そういうことを調べた論文もありますので（また、まっとうな実験書では参考文献としてちゃんとあげていますので）正確なところは自分で読んでみてください。

補足

ご丁寧に分かりやすく、すばやいお返事ありがとうございます。論文なども検索していと思います。しかし、一つほど確認させてください。エチブロは、260nmの波長自身は、励起されませんが、260nm付近に励起光をもち、励起されたDNAにより転移されたエネルギーによりエチブロが蛍光を発することができるということは、この転移されたエネルギーの波長はエチブロがもつ励起光の波長（300nm）と等しいのですよね？つまり、励起された二重鎖DNAの放射光の波長が、エチブロの励起光の波長とほぼ同じだから起こりうることなのでしょうか？励起エネルギー転移は、転移されるものの吸収波長の範囲になければ起こりえないのですよね？すみませんが、もう少しここのへんをお願いしたいのです。

回答No.2

Mr_Spock

>この転移されたエネルギーの波長はエチブロがもつ励起光の波長（300nm）と等しいのですよね？

波長を持った光が転移するのではなく、エネルギーそのものが転移すると理解してください。

励起光がもつ光エネルギーは、物質に吸収されると励起エネルギーに変換されます。励起エネルギーはすでに光とは形のことなるエネルギーのなので波長がどうとかいうのは問題外です。物質によって吸収しやすい波長がことなり、光エネルギーが励起エネルギーになりやすい波長がEtBrとDNAでは違うというだけで、異なる波長の光エネルギーでも励起エネルギーに変換されれば区別はないです。また、励起エネルギーになるのは光エネルギーだけではないです。たまたまこの系では光で励起しているというだけで、ある波長の光でなければ蛍光を発生できないということでもないです。

化学の教科書に励起や蛍光の話も載っているはずですので、この際、そのへんから勉強し直してはどうでしょう。

お礼

本当にすばやいお返事ありがとうございました。とても分かりやすいです。励起や蛍光の基本から学んでみようと思いました。どうもありがとうございました。