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(蛍光分光光度計)励起波長の設定について

(蛍光分光光度計)励起波長の設定について こんにちは、私は最近化学発光について研究をし始めた学生です。 先日、蛍光分光光度計を用いて化学発光のスペクトル測定をしていたのですが、その途中で疑問が1つ生じましたので投稿させていただきました。 励起波長を340nmと設定した場合、スペクトルは全く確認できず、ノイズのみのデータしか得られませんでした。 しかし、この励起波長を変化させているうちに、励起波長を750nmと設定した場合、明確なスペクトルが370nm辺りに確認できました。 なぜ750nmでスペクトルが確認できたのか、その理由が分かりません。 一応、750nmの励起波長を持つものはどこにも存在しない、と言う事だけは分かるんですが…。 ですので、ご存知の方に解説を頂けたらと思います。 蛍光分光光度計の測定条件は以下の通りです。 FP-6500 Xeランプ バンド幅:5nm 励起波長:750nm(340nm) 開始波長:360nm 終了波長:600nm 走査速度:200nm/min スペクトル測定に使用した試料は ルシフェリン-ルシフェラーゼ混合溶液(Mg入り) 蒸留水 ATP溶液 終濃度 5mM です。 よろしくお願いします。

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質問者が選んだベストアンサー

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  • kgu-2
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 研究者の姿勢として、研究内容をこのような掲示板で公開するのは、問題があります。学生なら、指導者がいるハズで、その人を無視していますから、私の研究室なら追放です。教えてgooにも、「課題の回答はダメ」というのなら、「研究内容の回答はもっとダメ」と2度ほど連絡したのですが、理解してもらえません。この管理者が科学というものを理解していないようで・・・。これは質問者も同じです。私も、学生時代に同じ失敗をしているのですが。  予想と違うことは、新発見のきっかけになるかもしれない、というのは学んでいると想います。質問者が理解できない事実なら、これに該当します。実際には、10回で1回くらいモノになる(=論文が書ける)かどうかですが。  発光分析と蛍光分析は、区別できていますか。発光分析は、光を照射しなくても光っている場合。蛍光分析は、光を照射し(=蛍光波長)、それより低いエネルギー(=長い波長)の蛍光を出すことを利用しています。ですから、750nmで照射し、370nmでの蛍光というのは、蛍光の原理に反します。重要なことなのか、質問者の力不足なのか、他の方の回答は理解できてイマンが、それなのかは分かりません。  私の場合は、100%測定条件の設定ミス。紫外部をガラスセルで測定しようとしたこともあります。ミスの積み重ね、恥の上塗り、によって、学生はどこをミスるのか予想でき、良い経験になっています。  聞くは一時の恥、でも、研究内容を掲示板で訊くのは、研究者として許されることではありません。指導者に訊きましょう。

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質問者からのお礼

ミスをするにしても自覚する事が大事なのですね。たいへん失礼しました。 以降はこの様な事が無いように致します。

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  • 回答No.1
  • tir70
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ルシフェリン-ルシフェラーゼの化学発光を測定するのに,励起光を使うのは,ナンセンスな勘違いです.励起光を入射して発光するのは蛍光といいますが,化学発光とは別物です.化学発光を蛍光分光器で測定する場合,励起光無しで,蛍光側だけ動作させます.でも,分光器の光学系が暗かったら,さっぱり測定できないかもしれません.試料を暗所で見たら,肉眼で光っているのは見えますか? >しかし、この励起波長を変化させているうちに、励起波長を750nmと設定した場合、明確なスペクトルが370nm辺りに確認できました。 アンチストークス蛍光の可能性がないとは言いませんが,たぶん,750nmの励起光に混じっていた375nmの2次回折光じゃありませんか?ピーク形状は鋭くありませんか?

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質問者からの補足

すみません。情報が足りませんでした。 実は励起光は出しておらず、蛍光側だけを動作させています。 にもかかわらず、励起波長を750nmに設定したら370nmでピークが見られました。 励起光源を出していないのに励起波長の設定をいじったらピークが見られたっていう点に大きな疑問があります。 あとは、装置内に試料セルを入れているので、分光器の光学系は暗いです。 暗所で光っているのは見えませんでした。 以前におかしいとは思ったので一応ルミノメーターで確認した所、ATP添加前(0.208)と添加後(9999以上)で数値が全然違ったために「なら大丈夫かな」と認識していました。 二次回折光かどうかはまだ調べてないので分かりませんが、ピーク幅は15nmくらいです。 多分、そこまで鋭くは無い方だと思うのですが… すみませんが、思う所があれば回答を頂けると助かります。

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