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分光光度計と蛍光分光光度計

「蛍光」の方で、励起光で、励起状態にした後の蛍光強度の測定というのは、分光光度計で同じ波長のODを測るのと同じ理屈でしょうか? 質問が、的を得ないですみません。 例えば、ある蛍光試薬の、蛍光波長が547nmだとして、励起 後の蛍光強度は、分光光度計で測定したODと同じはずなんでしょうか? 質問の内容が不明な部分は、補足いただくと助かります。 どうぞよろしくお願いします。

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  • kgu-2
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原理は知らなくても、使えれば良い、と思っていますので。その立場から回答します。ご質問の意図とズレテいればご容赦を >「蛍光」の方で、励起光で、励起状態にした後の蛍光強度の測定というのは、分光光度計で同じ波長のODを測るのと同じ理屈でしょうか?  全く違います。原理から言えば、分光光度計は吸光分析、蛍光は発光分析です。  分光光度計のセルは、二面だけが透明です。一方から入ってきた光を基準としてに、セルの中でどれだけ吸収されたか、それをセルから出てきた光の量との比で表します。比ですから、特定波長(普通は、極大吸収波長)では、どの分光光度計で測定しようと同じになります(pHなどの些細な条件を無視すれば)。また、誰が測ろうと同じ値になるハズなので、1モルの濃度の吸光度は、モル吸光係数として表すことができます。吸光度は、絶対的な値と考えることができます。  蛍光の場合は、4面透明のセルですね。30年も前に、「1個1万円(私の1ヶ月の生活費)」と聞いてビビッタことがあります。これは、一方から入ってきた光がセル内の蛍光物質に当たり、そこで蛍光を発します。これを入ってきた光が妨害しない90度の角度から測定します(ですから4面透明)。したがって、入ってくる光が強ければ強いほど、蛍光波長での値は大きくなります。すなわち、使う機械、温度などによって大きく左右されます。また、機械的に感度をあげて見かけ上の値を大きくすることも可能です。すなわち、相対的な値なのです。そこで、標準物質をもちいて、その相対的な値として表します。  溶液Aがある場合、吸光度は、どこで、どの機械で、誰が測ろうとも同じ値になります。モル吸光係数さえ分かれば、検量線を描かなくても、計算できます。  蛍光強度では、同じひとが同じ機械で測ろうと、同じ値には必ずしもなりません。ですから、毎回標準物質を用い、その相対的な値として表します。  なお、蛍光強度は、吸光どの1000倍程度の感度がある、と言われています。蛍光を用いるのは、感度が良いので、微量でも測れるからです。  

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質問者からのお礼

回答ありがとうございます。 非常によくわかりました。 また、質問することがあると思いますので その時はよろしくお願いします。

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  • 回答No.4
noname#21649
noname#21649

>同じ値が 濃度ですか。私が使っていた頃は光の強度しか測定する機会がなく.I/I0とかcpsだった頃です。 トレースアビリティ(と音で覚えているので表記は下記サイト三章)の話しでよいですか。 物を測定する場合方法はいくつもあります。しかし.ある方法を使った場合と.別の機械で測った場合で.内容が異なるということは大きな問題となります。 簡単な例としては.百貨店とかファンシーショップに売られているマンガの絵入の湿度計とか温度計。もし.同じ場所に置いてあるのであれば.全部同じ値を示す必要があります。ところが.結構バラけるのです。ここが問題なのです。どの機械でいつ測っても.使用公差(誤差)の範囲内で一致しなければ.どれを信じて良いのかわからなくなるのですから。 そこで.どの方法で計っても同じ結果になるように.測定機器の管理が行われるようになりました。これがトレースアビリティです。 具体的には.つくばの計量研とかきでんけんで行っているのですが.誤差の範囲内で必ず一致するように機会(けいりょうき)の管理をするようになっています。 http://www.nmij.jp/chishiki/trace.html

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お礼が遅くなって申し訳ございません。 再度の回答ありがとうございました。 また、よろしくお願いします。

  • 回答No.2
noname#160321
noname#160321

「OD」Optical Density(濃度)約しちゃうと専門家は「?」かも。 「すぐに解答ほしいです」なので、他にもっと分かった方の解答が出てくるまで待っていましたが、今のところ「専門家」の回答が無い様なので、「準専門家」から一言。 ご存知の様に分子を可視、紫外領域で励起しますと、#1のお答えにもあるように、有機物ではn→π*遷移、π→π*遷移が多く起こり、遷移金属ではもっぱらd→d遷移が起こります。 基底状態と励起状態のスピン多重度が「同一」の場合「許容」で多重度が変わる遷移は「禁制」ですよね。n→π*の吸収強度が小さいのも軌道の対称性で本来は「禁制」だからだということもご存知でしょう。 同様に蛍光発光でも同一多重度の基底状態へ「落下」(「励起」の対義語が分から無い。汗)します。 励起でも多くの場合基底状態の最低分子振動回転状態から同じ多重度の励起状態の最低分子振動回転状態とは各種の対称性から「禁制」遷移となるため、励起状態のそれも振動励起された構造への遷移となるため、吸収に「振動構造」が見られることもご存知だと思います。 つまりその分「余分」なエネルギーが必要なわけで、短波長側に分散されています。「落下」の場合も全く同じことが言え、落下してくる先は基底状態の振動励起状態になるため、今度は振動構造が長波長側に現れます。吸光と発光(この場合蛍光)のスペクトルが丁度「吸収の最長波長ピーク」と「蛍光の最短波長ピーク」の間のある波長を中心に「線対称」に見えることは良く知られています。(内容的にはただの見かけですが)分子量が大きくなると振動励起状態の数が増え吸収も発光も振動構造がきれいに見えなくなってしまいます。 さて、このような原理で発光(蛍光)が生ずるのですが、励起状態が基底状態に戻る場合「落下」して蛍光を生ずる場合ばかりではありません。特定の分子ではスピン多重度が違う状態へ振動回転構造の寄与によってかなりの量が「系間交差」し半減期の長い「燐光」を発してゆっくりと基底状態へ戻ります。「三重項増感剤」と呼ばれる分子の系間交差効率は非常に高くなります。また励起状態は「格子緩和」つまり基底状態の振動回転状態と交差して「熱的」に基底状態に戻ることも可能です。さらに場合によっては特定の結合が解離したり電子を失って「反応」を起こしてしまう場合もあります。 つまり励起された分子のすべてが「蛍光・発光」をするわけではないので、「蛍光の量子収率」は必ず1より小さな値になります。もちろん分解して全く別の物質になりその物質が「蛍光」を大きな強度で出すため量子収率が1を超える事もありますが、今回のご質問からは離れてしまいます。 ただし以下の事は言えます。安定な励起状態を持つ分子からの蛍光収率は一定です。つまり同波長、同強度の光を照射して得られる蛍光強度は溶質の濃度に比例します。ただし、吸収が強すぎてセルの中での受光強度が異なる様になると吸収も飽和し、発光も飽和します。 測定法は通常照射光と直交する面からの発光を測定していますが、照射しながらその散乱光も含んだ形での測定と、照射光を遮断したあとの減衰を見る方法と色々な装置が開発されています。特にフェムト秒まで計れる様になったので面白い研究や応用があり多くは既に実用化されています。

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質問者からのお礼

回答ありがとうございます。 わかる部分と、わからない部分があり、もう少しじっくり 頂いた回答を読み、自分でも勉強して、再度質問してみたいと思います。

  • 回答No.1
noname#21649
noname#21649

>るのと同じ理屈でしょうか? 「何の理屈」でしょうか補足ください。 雰囲気から.急行と醗酵のきこうでも説明すればよいかなと思い下のとおりに書きますが >同じはずなんでしょうか? {OD}が何の略語がわからないのですが。 有機物の蛍光は.nπかぱいぱい遷移でレイキしたときに.発する光を測定します。 分光光度法では.きゅうこうを測定しますので.レイキに要する光を測定する場合と.それ以外の光を測定している場合があります。 問題が.起動の不連続性です。変な起動(構造がゆがっだりしている場合)があったりする場合があります。熱となって逃げたりしますので.きゅうこうしたエネルギーとはっこうのエネルギーはおな時になりません(熱で起動が変化するために.へんなえ練るぎー順位のきどうがあるばあいがある)。

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質問者からのお礼

ありがとうございました。

質問者からの補足

回答ありがとうございます。 ます「OD」ですが、optical density のつもりで書きました。 失礼しました。 >「理屈」  実際、作業的には無理だと思うのですが、励起後の蛍光強度を、分光光度計で測っても、蛍光分光光度計で測ったのと同じ値がでるんだろうか?と思って質問してみました。

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