PCR法の結果のバンドで・・

質問

人間の毛根からDNA抽出しPCRを行いました。
マーカーの分子量の一番多い上のバンドは同様に太く出たのですが、分子量の一番軽い方が線状でなくもやっと霧状に広がっているのですが何故なんでしょうか。
実験目的は、どのくらいとれているかというのが問題だそうです。それってマーカーが太ければ沢山取れてることになるんですか？また、DNAのバンドから、これは何のDNAだ。とか何のタンパク質を作るDNAのバンドだとかって分かるんですか。
そもそもマーカーのDNAはもともと長いものなのに、なんでバンドが並んで１本でなく数本出るのですか。

質問が多くてすみません。いまいちよく理解できないで困っています。教えてください。

回答No.4

mizu_atsu · ベストアンサー

＞分子量の軽い方のバンドは、分子量の一番多いバンドが綺麗にでたのに、霧状になって広がって（1.58～0.83ｋｂのあたり全体に）でたのでしょうか？

人のサンプルは使ったことがないのですが、
RNAということはないでしょうか？

微生物の場合は500ベース付近にもやっとでるのですが
もしかするとひとだと大きいのかもしれない。

お礼

なるほど、そんな可能性があるのですね。
もう一度ちゃんと整理して、考察を考えようと思います。
とても参考になりました、回答ありがとうございます。

回答No.3

yamidan

＞マーカーの分子量の一番多い上のバンドは同様に太く出たのですが、分子量の一番軽い方が線状でなくもやっと霧状に広がっているのですが何故なんでしょうか。

まずマーカーと実際に電気泳動したサンプルに入っているものは違います。マーカーは分子量の目安を知るために使うものであって、決まった分子量の分子がもともと入っているものです。従って、分子量の大きいバンドがマーカーと同じ太さで出ることには何の意味もありません。たまたまそうなっただけです。分子量の小さいものがバンドにならなかったのは、分子量の小さいものがサンプル内にあまりなかったか、もしくはゲルを作る時やサンプルを穴に注入するときに失敗したかではないでしょうか。

＞それってマーカーが太ければ沢山取れてることになるんですか？

太さではなく重要なのは濃さです。バンドが太いよりは細くて濃い方が電気泳動がうまくいっているということです。バンドが太いと泳動距離の誤差が大きいということになります。

＞また、DNAのバンドから、これは何のDNAだ。とか何のタンパク質を作るDNAのバンドだとかって分かるんですか。

もともと塩基配列がわかっているのなら、どれがどのバンドかは分子量から推定することは可能です。ですが、電気泳動のバンドのみからＤＮＡの配列を推定することは無理です。

＞そもそもマーカーのDNAはもともと長いものなのに、なんでバンドが並んで１本でなく数本出るのですか。

ＰＣＲする前に制限酵素でＤＮＡを切断しているはずです。制限酵素は決まった配列を認識してＤＮＡを切断するので、サンプルごとに切れる位置が異なります。ですので人によって切断後のＤＮＡの分子量が異なるのです。
よく犯罪捜査なので使われるＤＮＡ鑑定はこれを使っています。同じ制限酵素で二つのサンプルを処理した場合、バンドが全く同じ場所で出れば、全く同じ分子量のＤＮＡに分かれたということですから、全く同じ場所で切断された可能性が非常に高いと判断でき、二つのサンプルは同一人物のものだと言えるのです。

お礼

バンドは太いより濃く細いほうがいいというのはRf値を求める際にとても困ったので納得しました。
分からないことが多くて、質問を羅列してしまったのですが、要点をマトメて回答してくださって有難うございました。

回答No.2

mizu_atsu

いまいち質問の意味がわかりませんが。。。

＞マーカーの分子量の一番多い上のバンドは同様に太く出たのですが、分子量の一番軽い方が線状でなくもやっと霧状に広がっているのですが何故なんでしょうか。

PCR産物の大きさを求めるため（もしくは量を推定するため）の分子量マーカーが分子量の大きなものほど太いのはなぜか？ということでしょうか？
そうであれば、マーカーはもともと1本のDNAを制限酵素で切ったものです。そのため各分子量のバンドに含まれる分子の数は同じになります。ですが、分子ひとつひとつの大きさは違います。そのため分子量の大きなもの程太く見えることになります。

＞マーカーが太ければ沢山取れてることになるんですか？

PCR産物が太ければ（濃ければ）たくさんとれていることになります。

＞DNAのバンドから、これは何のDNAだ。とか何のタンパク質を作るDNAのバンドだとかって分かるんですか。

今回の場合PCRしているので特定の遺伝子、または領域を増幅しています。そのためどういうものかはわかっているはずです。
特定のプライマーで増幅し、バンドが出てくればどういう遺伝子かは推定できます。ですが正確に知るにはシークエンスする必要があります。

＞マーカーのDNAはもともと長いものなのに、なんでバンドが並んで１本でなく数本出るのですか。

制限酵素によりDNAの特定の部分で切断しているからです。

補足

回答ありがとうございます。
説明不足ですみません。
もう少し教えて下さいお願いします。

＞マーカーの分子量の一番多い上のバンドは同様に太く出たのですが、分子量の一番軽い方が線状でなくもやっと霧状に広がっているのですが何故なんでしょうか。
というのは、マーカーと電気泳動用試料（抽出DNA）を電気泳動にかけて、マーカーのバンドは綺麗に分かれて出たのですが、電気泳動用試料の方は、マーカーの一番上（分子量の多い，マイナス端側の）のバンドが一本でただけで、あとは分子量の軽い方の部分にもやっとした霧のように広がっていました。
なぜ、分子量の軽い方のバンドは、分子量の一番多いバンドが綺麗にでたのに、霧状になって広がって（1.58～0.83ｋｂのあたり全体に）でたのでしょうか？
（制限酵素はEnzymeSlutionを使用しました）

説明が不十分で申し訳ありませんでした。
他の質問は解決しました。
ありがとうございます。

回答No.1

mmmma

多分PCR後の電気泳動の話ですよね。そのつもりで書いてみます。

＞マーカーの分子量の一番多い上のバンドは同様に太く出たのですが、分子量の一番軽い方が線状でなくもやっと霧状に広がっているのですが何故なんでしょうか。
ゲル内での泳動性が高いために四方に拡散してしまったのではないでしょうか。

＞マーカーが太ければ沢山取れてることになるんですか？
結果的にバンドが太くなることがあるとは思いますが基本的には蛍光強度が強いほど量が多いということになります。

＞DNAのバンドから、これは何のDNAだ。とか何のタンパク質を作るDNAのバンドだとかって分かるんですか。
電気泳動でわかるのは分子量だけです。ただし、やり方によっては塩基配列もわかります。それは次の質問のほうで…

＞そもそもマーカーのDNAはもともと長いものなのに、なんでバンドが並んで１本でなく数本出るのですか。
分子量マーカーでなくてPCR後のDNAのバンドのことですよね？DNAを抽出した後に制限酵素で処理しませんでしたか？このときに短く切れています。このとき制限酵素の種類をいろいろと変えてPCRを行って分子量測定をし、その結果から塩基配列を決定することができます。

お礼

回答ありがとうございます。
なんとなく糸口が見えてきました。
DNAを抽出した時の制限酵素をもう一度確認して考えてみようと思います。