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複数のプラスミドとベクター 論文訳について

めんどくさい質問ですみません。現在以下の論文を学校の課題で読んでいます。 マテリアル&メソッドの「遺伝子組換え」方法について記された部分なんですが・・・ 自分は遺伝子操作を行ったことがないので、理論は分かっているつもりだったんですが、意味がくみとれませんでしたorz 概要を説明すると、「AFR」というタンパクを大腸菌にて大量発現するために、遺伝子「afr gene」を含む組換え遺伝子をつくっているところです。 プラスミドとベクターがこんがらがってます。 質問は ・用いられてるベクター pCRII-TOPO 、pET24a(+) のちがいは? ・用いられてるプラスミドpPS18 、pA6Ch1、pA6Ch1HIS のちがいは? ・プラスミドに遺伝子を挿入したものをベクターとここではよんでいるのでしょうか? 全訳をかいていただく必要はないので、以上のことを読んでわかるひといたらお願いします。 The afr gene was amplified from genomic DNA (1 μg) of S. morlense S-30.7.5 by using the primers 5’-ATGAA(CT)CGCTGGGGACTGATCGGCGCGAGCACGAT-3’ and 5’-TCAAAGTCCCGTTTCGATCTCGAC-3’ derived from DNA sequences flanking the SMc04400 locus of the sequenced S. meliloti 1021 genome. The PCR product was separated in a 1% (wt/vol) agarose gel from which it was purified by using a MinElute gel extraction kit (QIAGEN) and then cloned into the vector pCRII-TOPO to yield plasmid pPS18 containing the 1-kb afr gene. Plasmid pPS18 was used as a template for subcloning afr into the expression vector pET24a(+) (Novagen, Darmstadt, Germany) via the NdeI and BamHI restriction sites of the primers 5’-TCTGCAGAATTCGCCCATATGAATCGCTGGGGACTGATC-3’ and 5’-AGTGTGCTGGAATTC GGATCCTCAAAGTCCCGTTTCGAT-3’ to yield plasmid pA6Ch1, which was transformed into E. coli BL21(DE3). To provide AFR with a C-terminal His6tag, plasmid pPS18 and the primers 5’-TCTGCAGAATTCGCCCATATGAATCGCTGGGGACTGATC-3’ and 5’-GGATCCTCA(GTG)6AAGTCCCGTTTCGATCTCGGC-3’ were used to introduce the afr fusion into pET24a(+), yielding plasmid pA6Ch1HIS for transformation into E. coli BL21(DE3). All inserts of the expression plasmids were verified by DNA sequence analysis.

noname#181407
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  • negigi
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確かに、遺伝子操作はやってみないと分かりにくいとは思いますが、課題は自分で調べるなり考えるなりしてね、と、先に言っておきます。 さて、 >プラスミドに遺伝子を挿入したものをベクターとここではよんでいるのでしょうか? ここでは、というよりも、一般的に、ベクターに目的遺伝子を挿入したものをプラスミドと呼びます。ベクターは、かなりざっくり説明すると、目的DNA配列を大腸菌などに導入し、増幅させたり、転写翻訳させたりするために、運び屋として働くものです。 プラスミドは、染色体とは独立した自律的複製を行うDNAの総称であり、一般的に、環状構造をとります。 >用いられてるベクター pCRII-TOPO 、pET24a(+) のちがいは? pCRII-TOPOはTOPOクローニングを利用して、PCR産物を一先ずクローニングするために使われるベクターです。Invitrogenのサイトに詳しいシステムの解説があるため、参照してください。これ単独では、タンパク発現させることはできず、目的配列をサブクローニングするために使われます。 pET24a(+)はpETシステムを利用して、大腸菌(BL21(DE3))内でタンパク質を発現させるために使います。詳しくはNovagenのサイトで検索してください。 >用いられてるプラスミドpPS18 、pA6Ch1、pA6Ch1HIS のちがいは? 上記説明で、なんとなく分かってきたかと思います。せっかくなので、自分で考えてみては?

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