BacteriaのRNA抽出に関する質問です。

質問

BacteriaのRNA抽出に関する質問です。

培養した菌体のcellからRNAをISOGENで回収→DNase処理→DNase失活→Kitで精製しているのですが、最終回収物を電気泳動するとスメアしています。
同様の方法で以前行ったときはそのようなことは一切なかったのですが・・・。

単純にクロモソーマルDNAが分解過程にあってスメアしているだけなのでしょうか?
仮にDNaseの量や反応時間を伸ばしたとしてRNAの純度やRNA自体の分解に影響はないのでしょうか?

時間もなく非常に焦っています。
ご回答いただければ幸いです。

回答No.1

Mr_Spock · ベストアンサー

RNase精製時に使うDNaseは、メーカーやブランドによって性能、品質がいろいろなのでよく吟味して選ぶ必要があると思います。最近はどの製品も品質が上がってきているとはいえ、ものによってはRNase-freeとうたっていても十分ではなかったり（使用中のコンタミは論外ですが）、DNAの分解がいまいちだったりすることはあります。

DNAのスメアだとしたらDNaseが十分に効いていない可能性があります。DNaseを十分に効かせるためには、Mg++やCa++が必要で、添付バッファーにそれらが加えられていると思います。この辺も製品ごといろいろで、Ca++が入っていないものも多いですが、入っているとDNaseの効き方が劇的に良くなります。

DNaseの失活方法は？　熱処理でしょうか。これらの金属イオンはそれ自体が触媒となって、高温下でRNAの分解を起こします。このためrRNAなどがスメアに見えているのかもしれません。

製品によっては失活液も付いていて（中身はキレーターだと思います）、こういう問題が起こらないように配慮されています。失活手段も提供されている製品なら安心だと思いますし、そうでなくても熱処理の前はキレーターの添加が勧められます。あるいは、その後、カラムなどで精製をしているなら、失活処理は必要ないかと思います。